本發明專利技術主要提供一種高效無性快繁三七再生植物的方法利--用生物反應器大量培養三七體細胞胚。從不定根誘導獲得的三七胚性愈傷組織增殖后，在含有0.5mg/L?2，4-D的MS條件下，100％的愈傷組織都產生了球形體細胞胚，且產生的體細胞胚數量最多。10.0g(約1.65×104個)球形胚培養在3L生物反應器內，反應器內裝有1.5L不加任何植物生長調節劑的1/2MS液體培養基，空氣通入量為0.15vvm。4周后球形胚都發育為子葉體細胞胚，且生物生長量增加約為原來的8倍。液體或固體培養獲得的子葉體細胞胚在含加有2.0mg/LGA3的1/2MS培養基中萌發成正常體細胞胚苗，繼而在不含任何植物生長調節劑的1/2MS培養基中繼代。生長良好的幼苗移栽入裝有人工土壤(泥煤苔和泥質巖(3∶1，v∶v))的營養杯中，溫室訓化成活率較高。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種利用小型生物反應器大量培養體細胞胚，簡單快速無性繁殖三七再生植株的方法。本專利技術屬于農業生物
技術介紹
三七(Panax notoginseng (Burk. ) F. H. Chen)又名田七、金不換、三七參等，為五加科人參屬植物，三七為我國傳統名貴中藥材，主要以塊根入藥。三七性溫，味甘、苦，具有止血鎮痛、活血化瘀、滋補強壯和消除疲勞增強體力之功效，傳統上常用于治療咳血、吐血、月·經過多、皮下出血及跌打和刀槍損傷等癥，具有多方面的藥理作用和保健功能，開發前景廣闊。由于三七同為人參屬植物，而它的有效活性物質又高于或多于人參，因此又被現代中藥藥物學家稱為“參中之王”。三七從播種至收獲，要經三年以上時間(王淑琴等，《中國三七》，1993)，種子又有休眠，需要經過3-6個月的層積處理期才能發芽。因此，利用現代生物技術一誘導體細胞胚發生途徑對其進行快速繁殖和種質保存一直是人們研究的問題。劉瑞駒等于1991年首次報道了三七組培苗的再生，他們以幼苗為材料，將莖、葉柄和葉分別進行離體培養，最后均從胚性愈傷組織中分化出胚狀體，進而發育成完整植株(劉瑞駒，植物生理學通訊，1991，27(3) :210)。次年，陳偉榮等利用三七花序誘導了胚性愈傷組織，通過體細胞胚發生途徑獲得再生植株(陳偉榮，華南農業大學學報，1992，13 (3) :69)。許鴻源等用葉片和葉柄作為外植體誘導獲得了體細胞胚再生植株(中國中藥雜志，2007，32 :481)。盡管對三七體細胞胚發生及其植株再生的研究較多，但是利用生物反應器大量培養三七體細胞胚還未有報道。本專利技術介紹的是利用一種生物反應器培養體細胞胚，快速生產體細胞胚及其小苗的方法。該專利技術為試管苗在生產中的利用打下了基礎。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種更快、更高效無性繁殖三七再生植物的方法一利用小型生物反應器培養三七體細胞胚快繁再生植株的方法。該專利技術也為三七的分子育種、規模化生產苗木提供技術支持。本專利技術主要是涉及誘導三七體細胞胚發生、發育、苗木移栽等過程中組織培養方法以及利用小型生物反應器(3L)培養大量培養體細胞胚的技術方法等。具體的
技術實現思路
的技術路線包括以下幾個部分的內容(I)三七胚性愈傷組織的誘導和增殖首先三七種子進行發芽處理，用發芽的無菌小苗誘導出不定根后，再將不定根切成約Icm的根段,接種到添加有I. Omg/L 2,4_D、30g/L鹿糖和3. Og/L gelrite的MS固體培養基中進行暗培養。5周后誘導出胚性愈傷組織，并進行繼代增殖。(2)體細胞胚發生的誘導和體細胞胚發育誘導增殖的胚性愈傷組織接種到含有不同濃度2，4-D的分化培養基中培養。4周后，在含有O. 5mg/L2，4-D處理的條件下，有100%的愈傷組織都產生了體細胞胚，且產生的體細胞胚數量最多。(3)小型生物反應器高效培養體細胞胚將誘導和增殖的胚性愈傷組織轉到添加有0-1. Omg/L 2，4_D，30g/L蔗糖和3. Og/L gelrite的MS固體培養基中進行暗培養，誘導體細胞胚發生。當球形胚形成后，將其接種到裝有不加2，4-D的1/2MS液體培養基的三角瓶(IOOml)中培養3周，以確定初始接種量與培養基量比例。然后將10. Og (大約I. 65 X IO4個)球形胚轉入3L生物反應器內培養，該反應器內裝有I. 5L不加任何植物生長調節劑1/2MS液體培養基，空氣通入量為O. 15vvm。4周后球形胚都發育為子葉體細胞胚，且生物生長量增加約為原來的8倍。(4)體細胞胚的萌發和馴化 上述液體或固體培養獲得的子葉體細胞胚轉入含有一系列濃度的GA3的1/2MS培養基中促進體細胞胚正常萌發成體細胞胚苗。然后三七體細胞胚幼苗轉入不加任何植物生長調節劑的1/2MS培養基中培養。之后，將生長良好的幼苗移栽入裝有人工土壤(泥煤苔和泥質巖(3 : l，v : v))的營養杯中，溫室(18 25°C)訓化3個月后，成活率為66.7%。本專利技術中所用的培養基都是按常規處理(調整pH值為5. 8，經過高溫高壓滅菌(121°C、I. 5個大氣壓、15分鐘))后使用的，培養環境為常規組織培養室(溫度24 26°C，光照強度1000 1500Lx，光/暗周期16h/8h，濕度60% 70% )。本專利技術的特征能更快更高效的繁殖三七再生植株1)生物反應器的工作量非常大，3L的小型生物反應器一個培養周期就可以生產約I. 65X IO4個體細胞胚；2)由于本專利技術中三七植株再生方式是體細胞胚途徑，再生植株能直接萌發成小苗，相對像器官發生途徑樣，節省了生根過程。附圖說明圖13L小型生物反應器大量培養三七體細胞胚。A，培養的不定根段(比例尺2.0cm) ；B,不定根在I. Omg/L 2，4_D的MS培養基中培養5周后誘導的胚性愈傷組織(比例尺2. 0cm) ;C，繼代擴增的愈傷組織(比例尺2. 0cm) ;D，E，分別是胚性愈傷組織在不加2，4-D(D)和加有O. 5mg/L 2，4_D(E)的MS培養基中培養4周后，分化的體細胞胚(比例尺I. 0cm) ；F, E中分化的球形體細胞胚發育到魚雷和子葉體胚(比例尺1. 0cm) ;G，懸浮培養E中分化的球形體細胞胚(比例尺1. 0cm) ;H，在不加任何植物生長調節劑的培養基中發育成熟的子葉體細胞胚(比例尺1. 7cm) ;1，通過懸浮培養獲得的體細胞胚培養在固體培養基(比例尺3.0mm) ;J，3L生物反應器懸浮培養4周E中的球形體細胞胚(比例尺1.0cm)；K，J中生物反應器培養的體細胞胚(比例尺5. 0mm) ;L，J中生物反應器培養的子葉體細胞胚(比例尺1· 5cm)。圖2體細胞胚萌發、植株轉化和土壤移栽。A，在不含激素的1/2MS培養中培養的子葉體細胞胚根形成但頂芽生長不好(比例尺5mm) ;B，體細胞胚在含有2. Omg/L GA31/2MS培養基中培養2周后根端和頂芽生長(比例尺1. 2cm) ;C，在1/2MS培養基中培養2個月后頂芽和根端發育良好的體細胞胚幼苗(比例尺1. 2cm) ;D，幼苗移栽入人工土壤中生長3個月后幸存的幼苗(比例尺7mm)；具體實施例方式實例I誘導三七體細胞胚發生、發育I)誘導三七胚性愈傷組織并進行增殖首先三七種子進行發芽處理，用發芽的無菌小苗誘導出不定根后，再將不定根切成約Icm的根段,接種到添加有I. Omg/L 2,4_D、30g/L鹿糖和3. Og/L gelrite的MS固體培養基中進行暗培養。5周后有大約50%的不定根誘導出了愈傷組織。愈傷組織都是從不定根的兩端切口地方產生，且松散、乳白色。這些愈傷組織每隔3周在同樣的培養基中繼代一次，很快增殖。2)誘導體細胞胚發生的和發育 誘導增殖的胚性愈傷組織接種到含有不同濃度2，4_D的分化培養基中培養。4周后，在含有O. 5mg/L2，4-D處理的條件下，有100%的愈傷組織都產生了體細胞胚，有100%的愈傷組織都產生了體細胞胚，且產生的體細胞胚數量最多，為32. 7個。黃色的球形體細胞胚形成于愈傷組織的表層細胞。其他處理體細胞胚的誘導率較低，平均每團愈傷組織產生的體細胞胚的數量較少(表I)。表I不同濃度的2，4-D對體細胞胚分化的影響本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種利用生物反應器培養體細胞胚快繁三七再生植株的方法，其特征在于包括以下步驟：1)利用無菌生生小苗的子葉、胚根、下胚軸等為外植體，通過常規培養方法獲得不定根后，將其切成1cm的根段，接種到添加有1.0mg/L？2，4？D、30g/L蔗糖和3.0g/L？gelrite的MS固體培養基中進行暗培養誘導獲得胚性愈傷組織，并在同樣的條件下繼代增殖；2)將胚性愈傷組織接種到含有0.5mg/L？2，4？D、30g/L蔗糖和3.0g/L？gelrite的MS固體培養基中進行暗培養，100％的愈傷組織都產生了球形體細胞胚，且產生的體細胞胚數量最多；將10.0g(大約1.65×104個)球形胚轉入3L生物反應器內培養，該反應器內裝有1.5L不加有任何植物生長調節劑的1/2MS液體培養基，通入空氣流量為0.15vvm。4周后球形胚都發育為子葉體細胞胚，且生物生長量增加約為原來的8倍；3)上述獲得的子葉體細胞胚轉入含加有2.0mg/LGA3的1/2MS培養基培養2周萌發成體細胞胚苗，之后轉入不加任何植物生長調節劑的1/2MS培養基中培養；4)將生長良好的幼苗移栽入裝有人工土壤(泥煤苔和泥質巖(3∶1，v∶v))的營養杯中，18～25℃溫室訓化3個月后，成活率為66.7％；5)步驟1)、2)、3)中所用的培養基都是按常規處理：調整pH值為5.8，經過高溫高壓滅菌(121℃、1.5個大氣壓、15分鐘后使用的，培養環境為常規組織培養室：溫度24～26℃，光照強度1000～1500Lx，光/暗周期16h/8h，濕度60％～70％。...
【技術特征摘要】
1. 一種利用生物反應器培養體細胞胚快繁三七再生植株的方法，其特征在于包括以下步驟 1)利用無菌生生小苗的子葉、胚根、下胚軸等為外植體，通過常規培養方法獲得不定根后，將其切成Icm的根段，接種到添加有I. Omg/L 2，4_D、30g/L蔗糖和3. Og/L gelrite的MS固體培養基中進行暗培養誘導獲得胚性愈傷組織，并在同樣的條件下繼代增殖； 2)將胚性愈傷組織接種 到含有O.5mg/L 2，4-D、30g/L蔗糖和3. Og/L gelrite的MS固體培養基中進行暗培養，100%的愈傷組織都產生了球形體細胞胚，且產生的體細胞胚數量最多；將10. Og(大約I. 65X IO4個)球形胚轉入3L生物反應器內培養，該反應器內裝有I.5L不加有任何植物生長調節劑的1...
【專利技術屬性】
技術研發人員：由香玲，詹亞光，李玉花，譚嘯，代金玲，陶雷，尹靜，
申請(專利權)人：東北林業大學，由香玲，
類型：發明
國別省市：
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