乙醇酸的酶促生產(chǎn)制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及乙醇酸的酶促生產(chǎn)。具體地，提供了由乙醇腈酶促生產(chǎn)乙醇酸的多種方法。這些方法包括：1)利用具有改善的用于將乙醇腈轉(zhuǎn)化為乙醇酸的腈水解酶活性的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體，和2)改善催化劑穩(wěn)定性和/或生產(chǎn)率的方法。該改善催化劑穩(wěn)定性和/或生產(chǎn)率的方法包括利用反應(yīng)穩(wěn)定劑，在基本上無氧的條件下運行反應(yīng)以及控制反應(yīng)混合物中底物的濃度。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及微生物學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地說，提供了一種使用具有改善的腈水解酶活性的突變的腈水解酶，由乙醇腈酶促生產(chǎn)乙醇酸的方法。
技術(shù)介紹
乙醇酸(H0CH2C00H ；CAS登記號為79-14-1)是羧酸的α -羥基酸家族的最簡單成員。其特性使之理想地廣泛用于消費和工業(yè)用途，包括用于水井修復(fù)、皮革工業(yè)、油氣工業(yè)、洗衣和紡織工業(yè)、在聚乙醇酸(PGA)制備中作為單體、以及作為個人護理產(chǎn)品成分。在多個行業(yè)中，乙醇酸還是的清潔劑的主要成分(乳制品和食品加工設(shè)別清潔劑、家用和機構(gòu)用清潔劑、工業(yè)清潔劑[用于運輸設(shè)備、磚石建筑、印刷電路板、不銹鋼鍋爐和加工設(shè)備、冷卻塔/熱交換器]、以及金屬加工[用于金屬酸洗、銅拋光、蝕刻、電鍍、電解拋光])。最近，已報道聚乙醇酸作為阻氣性材料(即顯示高阻氧特性)用于包裝食品及汽水(W02005/106005 Al)。然而，乙醇酸的傳統(tǒng)化學(xué)合成產(chǎn)生了大量的雜質(zhì)，在用于制備作為阻氣性材料的聚乙醇酸之前必須除去。商業(yè)化生產(chǎn)乙醇酸的新技術(shù)，特別是一種以高純度及低成本生產(chǎn)乙醇酸的技術(shù)，將是工業(yè)上所渴望獲得的。已知多種使用相應(yīng)的α-羥基腈作為原料以及微生物作為催化劑用于制備α-羥基酸的方法。所產(chǎn)生的α-羥基酸的例子包括乙醇酸、乳酸、2-羥基異丁酸、2-羥基-2-苯丙酸、苦杏仁酸、2-羥基-3，3- 二甲基-4- 丁內(nèi)酯和4-甲硫丁酸。這些產(chǎn)物是使用微生物合成的，例如屬于諾卡氏菌屬(Nocardia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、短桿菌屬(Brevibacterium)、金桿菌屬(Aureobacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、乳酪桿菌屬(Caseobacter)、產(chǎn)喊桿菌屬(Alcaligenes)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、腸桿菌屬(Enterobacter)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、埃希氏桿菌屬(Escherichia)、微球菌屬(Micrococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、枝動桿菌屬(Mycoplana)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)、歐文氏菌屬(Frwinia)、假絲酵母屬(Candida)、無芽孢桿菌屬(Bacteridium)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、旋孢腔菌屬(Cochliobolus)、鐮孢菌屬(Fusarium)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)、紅球菌屬(Rhodococcus)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、細桿菌屬(Microbacterium)、Obsumbacterium和戈登氏菌屬(Gordona)的那些微生物(相應(yīng)于 US 5，223，416 的 JP-A-4-99495、JP-A-4-99496 和 JP-A-4-218385 ;相應(yīng)于 US5，234，826 的 JP-A-4-99497 ;相應(yīng)于 US 5，296，373 的 JP-A-5-95795 ； JP-A-5-21987 ；相應(yīng)于 US 5，326，702 的 JP-A-5-192189 ;相應(yīng)于 EP-A-0610048 的 JP-A-6-237789 ;相應(yīng)于EP-A-0610049 的 JP-A-6-284899 ;相應(yīng)于 US 5，508，181 的 JP-A-7-213296)。然而，大多數(shù)已知的上述由相應(yīng)的α -羥基腈制備α _羥基酸的方法并不產(chǎn)生并以足夠高的濃度積聚產(chǎn)物，以滿足商業(yè)上的需要。經(jīng)常的結(jié)果是在反應(yīng)初期酶就失活。US5，756，306教導(dǎo)了“當(dāng)使用腈水解酶或腈水合酶酶促水解或水合α-羥基腈以產(chǎn)生羥基酸或α-羥基酰胺時，所出現(xiàn)的問題是在短時間內(nèi)酶失活。因此，難以以高濃度和高產(chǎn)率獲得α -羥基酸或α -羥基酰胺”(第I欄，第49-54行)。維持反應(yīng)混合物中醛濃度(由α-羥基腈解離為醛和氰化氫所形成的)和/或α-羥基腈濃度在規(guī)定的范圍內(nèi)是一種避免該問題的方法。US 5，508，181提出了涉及酶快速失活的更多困難。特別是，U. S. 5，508，181提及根據(jù)解離平衡，α-羥基腈化合物部分解離為相應(yīng)的醛。這些醛通過與蛋白結(jié)合，在短時間內(nèi)失活酶，因此很難由α-羥基腈以高產(chǎn)率獲得高濃度的α-羥基酸或α-羥基酰胺(第2欄，第16-29行)。阻止由于醛積聚所引起的酶失活的解決方案是將磷酸鹽或次磷酸鹽離子添加到反應(yīng)混合物中。US 5，326，702使用亞硫酸鹽、二亞硫酸鹽或連二亞硫酸鹽離子來 螯合醛并阻止酶失活。然而，即使通過使用上述這樣的添加劑，所產(chǎn)生和積聚的α-羥基酸的濃度仍然是不高的。U. S. 6，037，155教導(dǎo)了 α -羥基酸產(chǎn)物的低積聚與由于解離的醛積聚所引起的短時間內(nèi)酶失活相關(guān)。這些專利技術(shù)人提出在水中α-羥基腈部分解離所產(chǎn)生的氰化氫(Agricultural Biological Chemistry, Vol. 46, pages 1165 (1982))以及相應(yīng)的醒或酮(Chemical Reviews, Vol. 42, pages 189 (1948))存在下，酶活性受抑制。本專利技術(shù)人通過使用微生物解決了醛誘導(dǎo)的酶失活問題，所述微生物酶活性能通過將氰化物添加到反應(yīng)混合物中而得到改善。氰化物的添加限制了 α-羥基腈解離為醛和氰化氫。具體就乙醇酸生產(chǎn)來說，已知乙醇腈能可逆解離為氰化氫和甲醛，兩者都可失活酶活性。US 3，940，316描述了一種由相應(yīng)的腈制備有機酸的方法，使用了具有“腈水解(nitrilasic) ”活性的細菌，并列出乙醇腈作為底物。具體來說，該專利描述了對于該目的使用芽孢桿菌屬、無芽孢桿菌屬、微球菌屬和短桿菌屬細菌。雖然被描述具有腈水解活性，但是短桿菌R312 (Brevibacterium R312)是在US 3，940，316所有實施例中使用的唯一菌株。已知短桿菌R312具有腈水合酶和酰胺酶活性，但沒有腈水解酶活性(Toumeix等，Antonie van Leeuwenhoek, 52 :173-182(1986))。一種通過利用屬于棒狀桿菌(Corynebacterium spp.)的微生物制備乳酸、乙醇酸和2-羥基異丁酸的方法披露于日本專利公開號昭61-56086中。JP 09028390披露了一種通過紅球菌屬或戈登氏菌屬水解酶起作用，由乙醇腈制備乙醇酸的方法。報道了對乙醇酸的選擇性幾乎為100%，沒有乙醇酸酰胺生成。US 6，037，155披露了由α -羥基腈產(chǎn)生包括乙醇酸的α-羥基酸的方法的例子。該公開內(nèi)容承認由于前述問題之故并非所有的微生物催化劑都能產(chǎn)生高濃度的乙醇酸，并教導(dǎo)應(yīng)當(dāng)進行篩選研究以便發(fā)現(xiàn)在工業(yè)上有益的微生物。US 6, 037, 155具體鑒定了抗α-輕基腈或α -輕基酸抑制效應(yīng)的Variovorax spp.和節(jié)桿菌(Arthrobacter spp.)微生物,具有持久的活性,并能在高濃度下產(chǎn)生期望的產(chǎn)物。敏捷食酸菌(Acidovoraxfacilis) 72W(ATCC 55746)具有脂族腈水解酶(EC3.5. 5. 7)活性，以及腈水合酶(EC 4. 2. 本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種由乙醇腈生產(chǎn)乙醇酸的方法，包括：a)將適合的含水反應(yīng)混合物中的乙醇腈與包含具有腈水解酶活性的多肽的酶催化劑接觸，由此產(chǎn)生乙醇酸，所述多肽如SEQ？ID？NO:？30所示；和b)以鹽或酸的形式回收(a)中產(chǎn)生的乙醇酸；其中當(dāng)在相同的反應(yīng)條件下將乙醇腈轉(zhuǎn)化為乙醇酸時，相對于敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性，所述酶催化劑提供了至少1.5倍腈水解酶活性增加。

【技術(shù)特征摘要】
2004.12.22 US 60/638176中所提及的規(guī)定的特征、整體、步驟或組分的存在，但其并不排除一個或多個其他特征、整體、步驟、組分或它們的組的存在或添加。如本文所使用的，修飾所使用的本發(fā)明成分或反應(yīng)物的數(shù)量的術(shù)語“約”指數(shù)量上的變化，所述變化可例如通過用于在真實世界中制備濃縮物或使用溶液的標準量度和液體處理工序；通過在這些工序中的疏忽過失；通過用于制造組合物或執(zhí)行方法的產(chǎn)品、原料或配料純度的差異等產(chǎn)生。術(shù)語“約”還包含由于由特定的初始混合物產(chǎn)生的組合物的不同的平衡條件之故所相異的量。無論是否為術(shù)語“約”所修飾，權(quán)利要求包括相等的量。在一個實施方案中，術(shù)語“約”表示在所報告的數(shù)值的10%之內(nèi)，優(yōu)選在所報告的數(shù)值的5%·之內(nèi)。如本文所使用的，術(shù)語“回收”表示分離、純化或轉(zhuǎn)移利用本發(fā)明方法所生成的產(chǎn)物。分離和純化來自反應(yīng)混合物的產(chǎn)物的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，可包括但不限于選擇性沉淀、結(jié)晶、過濾、反應(yīng)性溶劑萃取、離子交換、電滲析、聚合、蒸餾、熱分解、醇解以及它們的組合。在一個實施方案中，術(shù)語“回收”還可包括將反應(yīng)混合物(通常在濾除酶催化劑之后)轉(zhuǎn)移到另一種反應(yīng)中以產(chǎn)生一種或多種額外的產(chǎn)物。如本文所使用的，術(shù)語“酶催化劑”或“微生物細胞催化劑”指具有用于將乙醇腈轉(zhuǎn)化為乙醇酸和氨的腈水解酶活性特性的催化劑(即包含至少一種具有腈水解酶活性的多肽)。酶催化劑可以完整的微生物細胞、透化處理的微生物細胞、微生物細胞提取物的一種或多種細胞成分、部分純化的酶或純化的酶的形式存在。酶催化劑可以是游離的(未固定的)或固定在可溶性或不溶性支持物中或其上。如本文所使用的，“再循環(huán)的酶催化劑”指在分批反應(yīng)中被再生為酶催化劑的酶催化劑。如本文所使用的，術(shù)語“催化劑生產(chǎn)率”和“酶催化劑生產(chǎn)率”指每克催化劑產(chǎn)生的產(chǎn)物總量。在本發(fā)明中，所述催化劑是腈水解酶(EC3. 5. 5. 7)，所產(chǎn)生的產(chǎn)物是乙醇酸和/或乙醇酸銨(取決于反應(yīng)的pH)。一般而言，在基本上pH中性的條件下進行本發(fā)明方法，以便所產(chǎn)生的乙醇酸主要以乙醇酸相應(yīng)的鹽(即乙醇酸銨)的形式存在。一般來說，在具有催化劑再循環(huán)的分批反應(yīng)中，隨每一次循環(huán)反應(yīng)催化劑活性而降低(酶失活)。如本文所使用的，術(shù)語“敏捷食酸菌(Acidovorax facilis) ”和“敏捷食酸菌(A. facilis)”可交換地使用，并指保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(國際保藏機構(gòu))，具有保藏號55746( “ATCC 55746”)的敏捷食酸菌72W。如本文所使用的,術(shù)語“大腸桿菌(Escherichia coli)”和“大腸桿菌(E. coli) ”可交換地使用。一些適合用于重組表達的大腸桿菌菌株描述于此，包括但不限于具有國際保藏編號ATCC 47076的大腸桿菌MG1655、具有國際保藏編號ATCC 53911的大腸桿菌FM5、具有國際保藏編號ATCC 27325的大腸桿菌W3110、具有國際保藏編號ATCC 35695的大腸桿菌MC4100和具有國際保藏編號ATCC 12435的大腸桿菌W1485。在一個實施方案中，適合的大腸桿菌菌株包括大腸桿菌FM5 (ATCC53911)和大腸桿菌MG1655 (ATCC 47076)。如本文所使用的，術(shù)語“大腸桿菌SS1001”或“SS1001”指表達敏捷食酸菌72W腈水解酶的轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株，具有ATCC登記號PTA-1177 (US 6，870, 038 ;其全文在此并入作為參考)。與野生型72W腈水解酶序列(SEQ ID NO :6)相比，重組表達的大腸桿菌SS1001腈水解酶(SEQ ID NO 38)含有2個小的序列改變。起始密碼子由GTG變?yōu)锳TG以利于重組表達，并在克隆過程中導(dǎo)入在C-末端附近引起單個氨基酸改變(Pro367[CCA] — Ser[TCA])的人工序列。如本文所使用的，術(shù)語“乙醇腈”縮寫為“GLN”，并且與羥基乙腈、2-羥基乙腈、羥基甲腈以及CAS登記號1...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：R迪科西莫，MS佩恩，A帕諾瓦，DP奧基夫，JS湯普森，
申請(專利權(quán))人：納幕爾杜邦公司，
類型：發(fā)明
國別省市：