本發(fā)明專利技術涉及一種β-甘露聚糖酶的高產方法，本方法是通過將一個編碼為內切β-甘露聚糖酶的多核苷酸被化學合成、克隆以及與a-因子信號肽結合后在胞外表達(受到乙醇氧化酶基因AOX1啟動子的控制)等過程。在一個500L的生物反應器中，所選的高表達工程菌株能分泌大約4g/L蛋白至培養(yǎng)液中，高表達菌株能產生約4305U/mL的β-甘露聚糖酶酶活。Co2+和Mn2+能顯著增強甘露聚糖的水解活性。產生的β-甘露聚糖酶能高效水解甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖。
【技術實現步驟摘要】
本技術屬于生物
，提供了，以及β -甘露聚糖酶水解甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖的應用。
技術介紹
植物細胞壁包含2種主要的多糖纖維素和半纖維素。由β -1,4-D-糖苷鍵連接的半纖維素主要由甘露聚糖組成。甘露聚糖大部分存在于初級植物細胞壁中，在次級細胞壁中含量較少。全世界每年產生大量含有甘露聚糖的農業(yè)廢棄物。在東南亞，每年產生數百萬噸含有甘露聚糖的棕櫚仁餅。在南美洲，咖啡產業(yè)和椰子油產業(yè)產生數百萬噸的咖啡廢物和椰子餅。棕櫚仁餅、椰子餅由于富含甘露聚糖等抗營養(yǎng)因子，只能作為低級的反芻動物飼料。β -甘露聚糖酶是一類能夠水解含β-1，4-甘露糖甘鍵的甘露寡糖和甘露多糖 (包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖等)的內切水解酶。甘露聚糖酶處理過的棕櫚仁餅和椰子餅已經顯示出良好的飼料價值，可以在畜禽飼料中使用。另外，甘露聚糖酶在造紙業(yè)和去污劑行業(yè)已經有良好的作用。當用包含甘露聚糖的生物材料生產生物燃料成為現實以后，甘露聚糖酶會越來越重要。畢赤酵母是一種甲基營養(yǎng)性酵母，能在普通培養(yǎng)基中產生較高細胞密度。它優(yōu)良的表達系統可以產生大量的酶和蛋白質，比如,葡聚糖酶、木聚糖酶、鞣酸酶、植酸酶和甘露聚糖酶。現有技術中，生產甘露聚糖酶的技術如下PCT W0/1999/024588公布了一個來源于番茄的具有編碼β-甘露聚糖內切酶的cDNA克隆體，用啟動子過度表達這個基因可以加快果實的成熟。PCT W0/1993/024622公布了一個編碼甘露聚糖內切酶的木霉的DNA序列，并將其導入到酵母或者真菌，誘導產生甘露聚糖內切酶，也是一種分離編碼甘露聚糖內切酶基因的方法。PCT W0/2006/126589公布了蝸牛，尤其是太平洋鮑魚，產生的一種甘露聚糖酶的特性，以及適用于水產領域大量生產酶制劑的技術。PCT W0/2008/062317公布了咖啡豆產生的β-甘露聚糖酶、編碼該蛋白的多核苷酸、表達系統以及含有該多核苷酸的宿主細胞。PCT W0/2001/098462和美國專利6，984，406公布了一株可產生在中性和酸性培養(yǎng)基中表現高酶活的甘露聚糖酶的芽孢桿菌菌株。甘露聚糖酶在飼料中用作添加劑，在半纖維素的分解中有很好的作用。PCT W0/2004/113538公布了一個地衣芽孢桿菌WL-12的編碼甘露聚糖酶的新基因，一個攜帶這個基因的重組質粒以及一個包含重組質粒的大腸桿菌轉化體。甘露聚糖酶把半乳甘露糖降解為甘露糖、甘露二糖和甘露三糖，酶在中性PH值和適當溫度條件下具有較高的活性，這個條件是動物生理條件相近。PCT W0/2003/012110 和美國專利 7,112,429 公布了 Acidothermuscellulolyticus產生的耐熱甘露聚糖酶。此項專利技術進一步公布了制造ManA重組型的方式以及酶制劑在食品加工和食品添加劑中的應用。PCT W0/1994/025576公布了棘孢曲霉CBS. 101. 43.產生的能表現甘露聚糖酶活的酶，認為這種酶用于降解或者改良植物或藻類細胞壁材料。PCT W0/2008/009673揭示了一個野生型里氏木霉產生的甘露聚糖酶的突變體及其核酸和氨基酸序列，該突變體插入、刪除和/或替代了一段氨基酸，具有更高的熱穩(wěn)定性、蛋白水解穩(wěn)定性、比活性、低PH條件下的穩(wěn)定性。PCT W0/2000/077155,W0/1999/009126,ff0/2000/042146,and W0/1999/009128 公布了一個包含甘露聚糖酶的配方，提高對于食品、化妝品臟污以及增白劑可能更好的清潔性能。PCT W0/1995/014809公布了用甘露聚糖酶制備漂白纖維素紙漿的工藝。·PCT W0/2001/062951 and W0/2001/064932公布了一個用乳化劑和甘露聚糖酶復合處理椰子柏生產改性椰子柏的工藝。通過這種方法，可以有效、經濟的釋放甘露聚糖。PCT W0/2001/064830公布了一個含有纖維素內切酶、木聚糖酶、β -甘露聚糖酶和/或α-淀粉酶的復合酶制劑處理方木中釀酒單寧酸的工藝。PCT W0/2003/062409公布了一個針對動物飼料的至少含有2種耐熱酶的配方，這2種酶是從葡聚糖內切酶，木聚糖酶，植酸酶，蛋白酶，半乳聚糖酶，甘露聚糖酶，聚糖酶，a_半乳糖苷酶中篩選出來的。首選的木聚糖酶從曲霉，芽孢桿菌屬，腐質霉屬，茶毒菌屬和木霉屬分離獲得。PCT W0/1996/036569公布了 I個阻止或者去除表面生物膜的配方，其中至少含有甘露聚糖酶，選擇性地和糖酶、蛋白酶、脂肪酶以及糖蛋白酶中的至少一種組合。PCT W0/2001/075084公布了從咖啡中獲得的至少可以編碼一種酶的DNA片段，這個酶可以水解由直鏈或支鏈甘露聚糖通過1，4_糖苷鍵連接組成的多糖。PCT W0/1994/020667公布了一種用酶預處理木材原材料的工藝，本處理可以減少機械打漿的能耗，提高纖維的性能，所用的酶為纖維二糖水解酶和甘露聚糖酶。PCT W01998/020750公布了甘露聚糖酶制劑在提高飼料植物蛋白原料價值的應用。PCT W0/1997/041739公布了在低能飼料中添加半纖維素酶(如甘露聚糖酶)提高單胃動物能量利用率的方法。PCT W0/2005/003319 and PCT W0/2007/095398 公布了甘露聚糖酶活性的多肽。美國專利7，148，399公布了從咖啡中獲得的至少可以編碼一種酶的DNA片段，這個酶可以水解由直鏈或支鏈甘露聚糖通過I，4-糖苷鍵連接組成的多糖。美國專利6，566，114公布了由芽孢桿菌1633基因編碼的新的甘露聚糖酶。該甘露聚糖酶為堿性，可用作清洗劑成分，以及用在壓裂液中用于壓裂地層，用于改良植物材料，以及用于處理纖維織物。美國專利6，060，299公布了一個枯草芽孢桿菌168多核苷酸分子編碼產生的新甘露聚糖酶。該甘露聚糖酶為堿性，可用作清洗劑成分，用于改良植物材料，以及用于處理纖維織物。美國專利4，895，800描述了克隆載體；畢赤酵母中甲醇誘導啟動子的使用以及變性蛋白的表達。有關在畢赤酵母中蛋白表達平臺的信息，比如，啟動子、轉化方法等，在美國專利 4，683，293 ;4，808，537 ;4，812，405 ;4，818，700 ;4，837，148 ;4，855，231 ;4，857，467 ；4，879，231 ;4，882，279 ;4，885，242 ;4，929，555 ;5，002，876 5，004，688 5，032，516 ；5，122，465 ;5，135，868 ;5，166，329 中可以見到。
技術實現思路
首先，本專利技術提供了一種β -甘露聚糖酶的高產方法。包括以下步驟(I) 一種合成的甘露聚糖酶基因與DNA載體中的啟動子結合，產生一個表達框；(2)將DNA載體接種到一個酵母細胞中，接種的酵母是巴斯德畢赤酵母，屬于畢赤酵母屬；(3)小規(guī)模培養(yǎng)條件下，通過測定β_甘露聚糖酶活性篩選出高表達菌株；(4)在500L的生物反應器中，篩選高表達甘露聚糖酶的菌株，高表達甘露聚糖酶的菌株產生4305U/mL的β -甘露聚糖酶酶活。 表達框由一個指示β -甘露聚糖酶分泌到細胞外培養(yǎng)液中的信號肽組成。首選的信號肽是α -因子，β -甘本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種生產β？甘露聚糖酶的方法，包括以下步驟：(1)一種合成的β？甘露聚糖酶基因與DNA載體中的啟動子結合，產生一個表達框，(2)將DNA載體接種到一個酵母細胞中，(3)小規(guī)模培養(yǎng)條件下，通過測定β？甘露聚糖酶活性篩選出高表達菌株，(4)在500L的生物反應器中，篩選高表達β？甘露聚糖酶的菌株
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：項文勝，王俊峰，李尚坤，
申請(專利權)人：江蘇奕農生物工程有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
還沒有人留言評論。發(fā)表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。