本發(fā)明專利技術涉及一種狼毒(Euphorbia?fischeriana)不定根的誘導及組織培養(yǎng)的方法，屬于細胞工程技術領域。包括(1)種子的萌發(fā)：狼毒種子經(jīng)HgCl2消毒后置于MS固體培養(yǎng)基上，于光照下萌發(fā)；(2)愈傷組織的誘導：將步驟(1)獲得的小苗置于含2，4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸、6-芐氨基腺嘌呤和椰子汁的MS固體培養(yǎng)基上，于無菌避光條件下誘導形成愈傷組織；(3)不定根的誘導：將步驟(2)獲得的愈傷組織置于含吲哚丁酸和椰子汁的MS固體培養(yǎng)基上，于無菌避光條件下誘導形成不定根；(4)不定根的培養(yǎng)：將步驟(3)獲得的不定根置于含有吲哚丁酸的MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。本發(fā)明專利技術方法簡單、有效物質(zhì)含量高。
【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術涉及的是一種細胞工程
的方法，特別是涉及一種。
技術介紹
狼毒是我國特有的、貴重中藥材之一，含殺蟲、殺菌及抗癌等多種生物活性物質(zhì)。 二職類化合物Prostratin (圖I)最早由Cashmore等人從新西蘭植物稻花一種(Pimelea prostrata)中分離得到。近年來，人們在太平洋島國薩摩亞的Mamala樹Homalanthus nutans中也分離到了該二職類化合物并且發(fā)現(xiàn)Prostratin能夠激活潛伏的HIV病毒,表現(xiàn)出良好的抗HIV的活性，有望開發(fā)成一種新藥，但人們經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)Mamala樹資源很少，其中的Prostratin的含量很低。我國的學者發(fā)現(xiàn)狼毒(Euphorbia fischeriana)的根中也含有Prostratin,但其Prostratin的含量也很低。由于狼毒大戟的生長受地理條件的限制， 資源十分有限，導致藥材供不應求，不能滿足醫(yī)藥市場的需求。為解決資源緊缺的問題，研究生物技術培養(yǎng)狼毒的方法成為當務之急。規(guī)模化藥用植物組織培養(yǎng)可以解決以上問題， 通過組織培養(yǎng)方法可以獲得有效成分含量高、生產(chǎn)周期短的狼毒組織培養(yǎng)物，從而代替野生或人工土地栽培的狼毒，既可解決占地問題，又可解決狼毒藥材的資源問題，具有重要的經(jīng)濟價值、生態(tài)效益和社會效益。不定根培養(yǎng)是上世紀80年代發(fā)展起來的一項細胞工程技術。不定根是一種分化的植物器官，是由植物的愈傷組織誘導而來。和懸浮培養(yǎng)細胞相比較，藥用植物的不定根其有效成分含量很穩(wěn)定；和大田人工栽培的植物相比，不僅有效成分含量高而穩(wěn)定，而且不定根培養(yǎng)不受氣候、土地等因素的影響，可以周年大規(guī)模生產(chǎn)，適合于藥用植物尤其是狼毒這種根類藥材的組織培養(yǎng)和規(guī)模化生產(chǎn)，以獲得狼毒藥材的替代物或生產(chǎn)其 主要有效成分。經(jīng)對現(xiàn)有文獻的檢索發(fā)現(xiàn)，目前除戴傳超等人進行了藥用植物京大戟(Euphorbia pekinensis)懸浮細胞培養(yǎng)的研究外(見戴傳超、余伯陽、薛菲、蔣繼宏，藥用植物大戟懸浮細胞的培養(yǎng)，南京林業(yè)大學學報(自然科學版)，2005，29 (2) :57-60)，尚無狼毒 (Euphorbia fischeriana)細胞、組織培養(yǎng)和生產(chǎn)方法的文獻報道，也未見有涉及狼毒 (Euphorbia fischeriana)不定根誘導及不定根培養(yǎng)體系建立的文獻報道。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術的目的在于針對狼毒(Euphorbia fischeriana)不定根細胞工程生產(chǎn)技術，提供一種。使其來自于自大田栽培狼毒植物的種子的無菌小苗在愈傷組織誘導基上誘導形成愈傷組織，并使狼毒愈傷組織在不定根誘導培養(yǎng)基上誘導形成不定根，形成一種規(guī)模大、周期短、質(zhì)量可控、成本低的不定根生產(chǎn)方法。本專利技術是通過下述技術方案實現(xiàn)的，包括如下具體步驟(I)狼毒無菌小苗的獲得取野生狼毒植株的種子置于MS固體培養(yǎng)基上，于光照培養(yǎng)條件下萌發(fā)成無菌小苗；(2)狼毒愈傷組織的誘導具體為取步驟(I)獲得的3厘米長的狼毒無菌小苗置于含2，4_ 二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、6-芐氨基腺嘌呤出-BA)三種植物生長調(diào)節(jié)劑和椰子汁的MS固體培養(yǎng)基上，于無菌避光條件下誘導形成愈傷組織；(3)狼毒不定根的誘導取步驟(2)獲得的狼毒愈傷組織置于含吲哚丁酸和椰子汁的MS固體培養(yǎng)基上，于無菌避光條件下誘導形成不定根；(4)狼毒不定根的培養(yǎng)取步驟(3)獲得的狼毒不定根置于含有吲哚丁酸的MS固體培養(yǎng)基上，于無菌避光條件下培養(yǎng)。步驟⑴中所述的小苗為誘導自野生狼毒植株的種子。步驟(2)中所述的愈傷組織，是指源于無菌小苗的愈傷組織。步驟(I)中所述的培養(yǎng)基，是指不含任何植物生長調(diào)節(jié)劑的MS固體培養(yǎng)基。步驟(I)中所述的光照培養(yǎng)條件下，是指于24_26°C、3000勒克斯(Iux)光照強度的條件下誘導25-30天。步驟(2)中所述的培養(yǎng)基，是指含有0.2-2mg/L 2，4_ 二氯苯氧乙酸(2，4_D)、O.1-lmg/L 萘乙酸(NAA)、0· 02-0. 2mg/L 6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)和 2_3ml/L 椰子汁的 MS 固體培養(yǎng)基。步驟(2)中所述的無菌避光條件下，是指于24_26°C無菌避光條件下誘導25_30天。步驟(3)中所述的培養(yǎng)基，是指含有5-20mg/L吲哚丁酸和l_2ml/L椰子汁的MS固體培養(yǎng)基。步驟(3)中所述的無菌避光條件下，是指于24_26°C無菌避光條件下誘導25_30天。·0019]步驟(4)中所述的培養(yǎng)基，是指含有l(wèi)_2mg/L吲哚丁酸的MS固體培養(yǎng)基。步驟(4)中所述的無菌避光條件下，是指于24_26°C無菌避光條件下誘導25_30天。本專利技術方法簡便、效率高，來源于狼毒無菌小苗愈傷組織不定根的誘導率在 90. 0%以上，狼毒有效物質(zhì)prostratin含量高，建立了完善的不定根培養(yǎng)體系。附圖說明圖I為狼毒有效物質(zhì)prostratin的化學結構圖。圖2為prostratin標準品的高效液相色譜圖。圖3為狼毒不定根樣品的高效液相色譜圖。圖4為狼毒不定根樣品加prostratin標準品后的高效液相色譜圖。具體實施方式實施例I :狼毒種子的萌發(fā)取野生狼毒植株的種子，經(jīng)O. 2% HgCl2消毒12分鐘、用無菌水沖洗3遍后置于不含任何植物生長調(diào)節(jié)劑的MS固體培養(yǎng)基上，于26°C、3000勒克司(Iux)光照條件下培養(yǎng)25 天，即可萌發(fā)成小苗。實施效果狼毒種子的萌發(fā)率達5.0%，所萌發(fā)成的無菌小苗具有完整的根、莖、葉，生長正常。實施例2 :狼毒愈傷組織的誘導將實施例I獲得的3厘米長的狼毒無菌小苗置于含lmg/L 2，4_ 二氯苯氧乙酸(2， 4-D)，0. 5mg/L萘乙酸，O. lmg/L 6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)三種植物生長調(diào)節(jié)劑和3ml/L椰子汁的MS固體培養(yǎng)基上，于24-26°C無菌避光條件下誘導25天，即得到狼毒的愈傷組織。實施效果狼毒愈傷組織誘導率達80. O %。2，4-二氯苯氧乙酸(2，4_D)，萘乙酸， 6-芐氨基腺嘌呤這三種植物生長調(diào)節(jié)劑和椰子汁的共同作用促進了愈傷組織的形成和生長。實施例3 :狼毒不定根的誘導將實施例2獲得的狼毒愈傷組織置于含10mg/L吲哚丁酸這種植物生長調(diào)節(jié)劑和 2ml/L椰子汁的MS固體培養(yǎng)基上，于24-26°C無菌避光條件誘導培養(yǎng)25天，即得到狼毒的不定根。實施效果不定根誘導率達90. 0%，不定根細、短，并側向分生出細、短的不定根， 不定根發(fā)生輕微的愈傷化。實施例4 :狼毒不定根固體培養(yǎng)體系的建立將實施例3獲得的狼毒不定根從其母體愈傷組織上分離，將分離到的不定根置于含有2mg/L吲哚丁酸的MS固體培養(yǎng)基上，于24-26°C無菌避光條件誘導培養(yǎng)25天，即得到大量的狼毒的不定根。實施效果建立了不定根的體外固體培養(yǎng)體系，側向分生出大量細長的不定根。經(jīng)高效液相色譜儀分析，所得狼毒不定根中有效物質(zhì)prostratin的含量為42. 21 μ g/g干重。權利要求1.一種狼毒(Euphorbia fischeriana)不定根的誘導及組織培養(yǎng)的方法,其特征在于，包括以下具體步驟(1)狼毒無菌小苗的獲得取狼毒的種子置于MS固體培養(yǎng)基上，于光照培養(yǎng)條件下萌發(fā)成無菌小苗；(2)狼毒愈傷組織的誘導具體為取步驟(I)獲得的3厘米長的狼毒無菌小苗置于本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
一種狼毒(Euphorbia？fischeriana)不定根的誘導及組織培養(yǎng)的方法，其特征在于，包括以下具體步驟：(1)狼毒無菌小苗的獲得：取狼毒的種子置于MS固體培養(yǎng)基上，于光照培養(yǎng)條件下萌發(fā)成無菌小苗；(2)狼毒愈傷組織的誘導：具體為取步驟(1)獲得的3厘米長的狼毒無菌小苗置于含2，4？二氯苯氧乙酸(2，4？D)、萘乙酸(NAA)、6？芐氨基腺嘌呤(6？BA)三種植物生長調(diào)節(jié)劑和椰子汁的MS固體培養(yǎng)基上，于無菌避光條件下誘導形成愈傷組織；(3)狼毒不定根的誘導：取步驟(2)獲得的狼毒愈傷組織置于含吲哚丁酸和椰子汁的MS固體培養(yǎng)基上，于無菌避光條件下誘導形成不定根；(4)狼毒不定根的培養(yǎng)：取步驟(3)獲得的狼毒不定根置于含有吲哚丁酸的MS固體培養(yǎng)基上，于無菌避光條件下培養(yǎng)。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：邱德有，劉洪偉，楊艷芳，張楠，
申請(專利權)人：中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：
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