一種野生蕙蘭組織培養方法技術

本發明專利技術公開了一種野生蕙蘭組織培養方法，包括外植體的選擇、外植體處理、培養基配制3個方面：選擇蕙蘭假鱗莖葉腋處的側芽作為外植體；本發明專利技術采用1/2MS培養基，一方面有利于前期外植體的誘導，節約了化學試劑，降低了生產成本，也減少了環境污染。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于農業
，涉及一種植物快速擴繁技術，具體涉及。
技術介紹
蘭花作為一種著名花卉，在世界花卉產業中占有十分重要的地位。在全球蘭花貿易中，主要以蝴蝶蘭、大花蕙蘭、文心蘭、石斛蘭、卡特蘭、兜蘭、萬代蘭、文心蘭等熱帶蘭附生蘭為主，也就是所謂的“洋蘭”。與洋蘭相比，國蘭并不具備碩大的花型、艷麗的色彩和挺長的花序，但是國蘭它風姿飄逸，神韻高雅，且常有清香甚至異香，這些都是洋蘭所沒有的。國蘭在我國有悠久的栽培歷史和深厚的文化底蘊，是深受中國人喜愛的傳統名花，在日本、韓國以及東南亞的許多國家也很受歡迎，國際上又稱國蘭為“東方蘭”。國蘭素淡的花色、雅致的花姿、清幽的花香、`婀娜的葉姿和多變的葉藝近年來也逐漸被歐洲消費者所接收，所以不論是國內花卉市場還國際蘭花市場上，國蘭蘊藏著不可估量市場價值。盡管國蘭在我國已有千余年的栽培歷史，盡管我們有全世界最豐富的國蘭野生資源，然而，國蘭在我國花卉產業中卻一直處于微不足道的地位，始終沒有能夠成為一項主導產業。目前國蘭的市場狀況是，繁殖主要采用分株方式，即使產業化程度較高的企業所采用的繁殖方式，也基本上還是采用傳統分株繁殖方式；生產模式以家庭小作坊為主，栽培設施簡陋，交易市場以民間私人交易為主，精品蘭花掌握在民間少數私人手中，其實質是一個投資市場，蘭花只是充當了一個資金流動的載體，至使“天價蘭花”一度成為公眾關注的焦點問題。(所謂精品蘭花實際是野生蘭花的自然變異，因為自然界蘭花自然變異的幾率非常小，且具有唯一性，加上中國文化賦予這個植物高雅逸致、超凡脫俗的文化內涵，使得精品國蘭近乎成為類似文物和古董那樣的投資收藏品)。由于國蘭自然分株繁殖速度慢，繁殖系數低，種源主要來自野生資源，致使一些人對蘭花野生資源的瘋狂采挖，使蘭花的野生原始資源遭到了極大的破壞。上述情況情況似乎為國蘭所特有，因為沒有任何一種花卉是依靠銷售野生資源來維持其產業的。目前蘭花領域的學者以及蘭界業內人士都一致認為，出現這種情況的根本原因是，國蘭目前還沒有實現真正意義上的產業化生產，產業化生產是國蘭發展的必由之路。要實現一種作物的產業化生產，必須要有成熟而且有效的繁殖技術。所以繁殖問題是制約國蘭產業化的關鍵。目前組織培養技術主要應用于蝴蝶蘭、大花蕙蘭等洋蘭，組織培養核心技術主要由臺灣等大的公司和企業控制，國內洋蘭企業大部分從事的是種苗、試管苗或者原球莖一下的下游產業環節。至于國蘭，國內少數研究單位或公司掌握了春蘭的組織培養技術，但組培對象是人工馴化栽培多年的品種，對野生國蘭的組織培養國內尚沒有成功報道的例子，尤其是野生蕙蘭。
技術實現思路
為了解決上述技術問題，本專利技術提供，本專利技術在多年試驗的基礎上，針對野生蕙蘭提出了一套有效的組織培養技術體系。具體技術方案為，包括外植體的選擇、外植體處理、培養基配制3個方面(I)外植體選擇選擇蕙蘭假鱗莖葉腋處的側芽作為外植體；(2)外植體處理步驟為I)、將步驟(I)中選好的外植體，從母體切離假鱗莖，切除所有肉質根系及上部葉片，只保留下面5厘米葉片；`2)、將切除下來的假鱗莖置于流水下沖洗10分鐘；3)、用鑷子從基部依次從外向內剝離假鱗莖上的葉片，露出葉腋處的側芽；4)、將剝離葉片露出側芽的假鱗莖在流水下沖洗20分鐘，然后置于洗衣粉溶液中浸泡15分鐘，洗衣粉溶液濃度為10毫升水/克洗衣粉，期間用干凈玻璃棒攪拌3次；5)、浸泡后取出置于流水下沖洗5分鐘，用自來水洗3次；6)、用無菌濾紙吸干表面的水，在無菌濾紙上用手術刀小心地切取側芽，用消毒紗布包裹，注意保證側芽完整無損；7)、將包有側芽的紗布包裹置于75 %的乙醇中，5秒后，從乙醇溶液中取出，用蒸餾水沖洗3次；8)、用鑷子仔細把側芽從紗布包裹中取出，置于小燒杯中，用蒸餾水沖洗5次，浙干;9)、加入消毒液蒸餾水為I : 5的“84”消毒液浸泡15分鐘，期間用玻璃棒攪拌5次；10),15分鐘以后浙去消毒水，用蒸餾水沖洗5次，浙干后置于超凈工作臺準備接種。(3)培養基配制，配制好6種母液，以I升培養基為例，用移液管分別取10毫升母液1，5毫升母液2，5毫升母液3，5毫升母液4，5毫升母液5，5毫升母液6，混合，加蒸餾水至450毫升，攪拌制成基本培養基；然后分別精確秤取毫克NAA，2. I毫克6_BA，20毫克蔗糖，6. 5毫克瓊脂，2毫克PVP，分別用適量蒸餾水溶解混合在容器中，用蒸餾水稀釋至450毫升，充分攪拌后與前面配好的450毫升基本培養基混合，用蒸餾水定容至I升。然后加熱，邊加熱邊攪拌，直到瓊脂粉完全溶解，加熱至沸騰即可停止，再用蒸餾水補充到I升，加熱過程有蒸發，接下來在精確的PH計上用O. lmol/L的NaOH和O. lmol/L的HCl調整pH至5. 7。注意在帶有溫度補償功能的PH計上調節pH值，必須在瓊脂凝固前完成。步驟(3)中，培養基配方為(I)、配制MS基本培養基母液I : (50倍母液，配I升培養基取此母液20毫升)NH4NO3 82. 5gKNO3 95gMgSO4. 7H20 18. 5g蒸餾水1000ml母液2 (100倍母液，配I升培養基取此母液10毫升)CaCl. 2H20 22g蒸餾水500ml 母液3 (100倍母液，配I升培養基取此母液10毫升)KH2PO4 8. 5g蒸餾水500ml母液4 (100倍母液，配I升培養基取此母液10毫升)FeSO4. 7H20 2. 75gNa2. EDTA 3. 73g蒸餾水1000ml母液5 (100倍母液，配I升培養基取此母液10毫升)MnSO4. 4H20 2230mgZnSO4. 7H20 860mgH3BO3 620mgKI 83mgNa2MoO4. 2H20 :12. 5mgCoCl· 6H20 I. 25mgCuSO4. 5H20 I. 25mg蒸餾水1000ml母液6 (100倍母液，配I升培養基取此母液10毫升)肌醇5g煙酸25mgVbi 5mgVB6 25mg甘氨酸IOOmg蒸餾水500ml(2)、培養基配方基本培養基用1/2MS培養基，即用蒸餾水稀釋I倍。NAA I. 8mg/L6-BA 2. lmg/L蔗糖20mg/L瓊脂6. 5mg/LPVP 2mg/LpH :5. 7進一步，母液4配制的時候，先分別秤取2. 75克FeSO4. 7H20和3. 73克Na2. EDTA,各自溶解于450毫升的蒸餾水中，攪拌或加熱至完全溶解，然后將兩種溶液混合，同時倒入第三個I升容量的燒杯，調整pH值至5. 5，最后定容I升。本專利技術的有益效果與現有的相關技術相比，本專利技術組織培養外植體選用側芽，而現有技術體系外植體采用頂芽或莖尖，每個蕙蘭假鱗莖僅有一個頂芽或莖尖，而側芽的數量一般在5-12個，相比現有技術，本專利技術對外植體的利用率比現有技術提高了數倍或十幾倍。現有技術外植體消毒多采用升汞或其他對人體或環境有害的試劑，本專利技術采用“84”消毒液對外植體進行消毒，其消毒效果與現有技術相同，“84”消毒液的主要成分是次氯酸鈉(自來水消毒用的就是次氯酸鈉)。本專利技術外植體的消毒方法與現有技術相比，一方面大大降低了消毒成本，另一方面減少了有害試劑對操作人員的威脅，同時也極大減少了有毒有害試劑對環境的污染。現有技術多采用MS基本培本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種野生蕙蘭組織培養方法，其特征在于，包括外植體的選擇、外植體處理、培養基配制3個方面：(1)外植體選擇：選擇蕙蘭假鱗莖葉腋處的側芽作為外植體；(2)外植體處理步驟為：1)、將步驟(1)中選好的外植體，從母體切離假鱗莖，切除所有肉質根系及上部葉片，只保留下面5厘米葉片；2)、將切除下來的假鱗莖置于流水下沖洗10分鐘；3)、用鑷子從基部依次從外向內剝離假鱗莖上的葉片，露出葉腋處的側芽；4)、將剝離葉片露出側芽的假鱗莖在流水下沖洗20分鐘，然后置于洗衣粉溶液中浸泡15分鐘，洗衣粉溶液濃度為10毫升水/克洗衣粉，期間用干凈玻璃棒攪拌3次；5)、浸泡后取出置于流水下沖洗5分鐘，用自來水洗3次；6)、用無菌濾紙吸干表面的水，在無菌濾紙上用手術刀小心地切取側芽，用消毒紗布包裹，注意保證側芽完整無損；7)、將包有側芽的紗布包裹置于75％的乙醇中，5秒后，從乙醇溶液中取出，用蒸餾水沖洗3次；8)、用鑷子仔細把側芽從紗布包裹中取出，置于小燒杯中，用蒸餾水沖洗5次，瀝干；9)、加入消毒液∶蒸餾水為1∶5的“84”消毒液浸泡15分鐘，期間用玻璃棒攪拌5次；10)、15分鐘以后瀝去消毒水，用蒸餾水沖洗5次，瀝干后置于超凈工作臺準備接種；(3)培養基配制？配制6種母液，用移液管分別取10毫升母液1，5毫升母液2，5毫升母液3，5毫升母液4，5毫升母液5，5毫升母液6，混合，加蒸餾水至450毫升，攪拌制成基本培養基；然后分別精確秤取毫克NAA，2.1毫克6？BA，20毫克蔗糖，6.5毫克瓊脂，2毫克PVP，分別用適量蒸餾水溶解混合在容器中，用蒸餾水稀釋至450毫升，充分攪拌后與前面配好的450毫升基本培養基混合，用蒸餾水定容至1升，然后加熱，邊加熱邊攪拌，直到瓊脂粉完全溶解，加熱至沸騰即可停止，再用蒸餾水補充到1升，加熱過程有蒸發，接下來在精確的pH計上用0.1mol/L的NaOH和0.1mol/L的HCl調整pH至5.7。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：宋軍陽，張顯，劉建軍，張寧，王保寧，
申請(專利權)人：西北農林科技大學，
類型：發明
國別省市：