篩選抗體的方法技術

本發明專利技術提供生產用于抗體篩選試驗的抗體偶聯物的方法和由權利要求的方法生產的抗體偶聯物。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】本申請要求于2010年3月2日提交的美國臨時申請第61/309，725號和2010年4月13日提交的美國臨時申請第61/323，433號的權益，每個申請都通過引用全文納入本文以用于所有目的。
技術介紹
癌癥細胞上的抗體藥物偶聯物(ADC)的活性能受到眾多因素的影響，例如結合親和性、內化速率、亞細胞運輸和靶標細胞群內有效的藥物釋放。因此，用于藥物遞送的理想抗體的屬性與用 于治療性非偶聯抗體的那些不是必需相同。另外，由于細胞表面的交聯能造成下游事件的改變，并且二抗的所述親和性限制試驗的動態范圍，涉及使用二抗以篩選最佳ADC的間接試驗可能會誤導。由于這些結果提供能影響細胞毒性活性的參數的直接測量，當尋求針對ADC治療新抗原的候選抗體時，因此最需要篩選ADC形式的大量抗體組和評價其細胞毒性活性。然而，當處理抗體開發活動常見的微克數量的大量抗體時，傳統偶聯方法的產率有限制。需要篩選抗體用作ADC的改進方法。本專利技術解決了這種和其它需求。
技術實現思路
本專利技術提供生產用于抗體篩選試驗的抗體偶聯物的方法和由權利要求的方法生產抗體偶聯物。在一些實施方式中，所述方法包含提供含有第一和第二抗體樣品的方法，其中所述含有第一和第二抗體樣品根據抗體數量和抗體序列不相同，前提是所述第一樣品中出現的所有抗體基本具有相同序列并且所述第二樣品中出現的所有抗體基本上是相同序列；固定所述抗體到固體支持物上以提供包含固定抗體的第一和第二樣品；充分還原所述固定抗體的可還原二硫鍵以提供包含經還原固定抗體的第一樣品和包含經還原固定抗體的第二樣品，其中所述還原對可還原二硫鍵有選擇性；還原的固定抗體與封端劑、藥物或藥物接頭和可選的檢測劑反應以提供固定抗體偶聯物，其中所述封端劑、藥物或藥物接頭和可選的檢測劑與活性巰基選擇性反應，所述封端劑、藥物或藥物接頭和可選的檢測劑以摩爾過量提供，并且選擇封端劑、藥物或藥物接頭和可選檢測劑的比率以實現所需藥物加載水平；和洗脫所述抗體偶聯物以提供游離抗體偶聯物的第一樣品和游離抗體偶聯物的第二樣品。在一些實施方式中，所述方法包含提供含有多個雜交瘤克隆所生成未定量抗體的多個未純化雜交瘤上清液樣品的步驟，其中所述多個樣品根據抗體數量和抗體序列不相同，前提是大部分的所述多個樣品中，每個樣品中出現的所有抗體基本上來自單個雜交瘤克隆；固定所述未定量抗體到固體支持物上以提供包含固定抗體的多個樣品；充分還原所述固定抗體的鏈間二硫鍵以提供包含經還原固定抗體的多個樣品；還原的固定抗體與封端齊U、藥物或藥物接頭和檢測劑反應以提供固定抗體偶聯物，其中所述封端劑、藥物或藥物接頭和檢測劑與活性巰基選擇性反應，所述封端劑、藥物或藥物接頭和可選的檢測劑以摩爾過量提供，并且選擇封端劑、藥物或藥物接頭和檢測劑的比率以實現所需藥物加載水平；和從所述固體支持物洗脫所述抗體偶聯物以提供多個抗體偶聯組合物。在一些實施方式中，所述方法包含提供含有根據抗體數量和抗體序列不相同的樣品的多個抗體的步驟，前提是大部分的所述多個包含抗體樣品中，單一樣品中出現的所有抗體基本具有相同序列；固定所述抗體到固體支持物上以提供包含固定抗體的多個樣品；充分還原所述固定抗體的可還原二硫鍵以提供包含經還原固定抗體的多個樣品，其中所述還原對可還原二硫鍵有選擇性；還原的固定抗體與封端劑、藥物或藥物接頭和可選的檢測劑反應以提供包含固定抗體偶聯物的多個樣品，其中所述封端劑、藥物或藥物接頭和可選的檢測劑與活性巰基選擇性反應，所述封端劑、藥物或藥物接頭和可選的檢測劑以摩爾過量提供，并且選擇封端劑、藥物或藥物接頭和可選檢測劑的比率以實現所需藥物加載水平；和洗脫所述抗體偶聯物以提供含游離抗體偶聯物的多個抗體偶聯組合物。在一些實施方式中，所述方法包含提供含有根據抗體數量和抗體序列不相同的樣品的多個抗體的步驟，前提是大部分的所述多個包含抗體的樣品中，單一樣品中出現的所有抗體基本具有相同序列；固定所述抗體到固體支持物上以提供包含固定抗體的多個樣品；充分還原所述固定抗體的可還原二硫鍵以提供包含經還原固定抗體的多個樣品，其中所述還原對可還原二硫鍵有選擇性；還原的固定抗體與封端劑和檢測劑反應以提供包含固定抗體偶聯物的多個樣品，其中所述封端劑和檢測劑與活性巰基選擇性反應，所述封端劑 劑加載水平；和洗脫所述抗體偶聯物以提供含游離抗體偶聯物的多個抗體偶聯物組合物。在一些實施方式中，所述方法包含提供含有根據抗體數量和抗體序列不相同的樣品的多個抗體的步驟，前提是大部分的所述多個包含抗體的樣品中，單一樣品中出現的所有抗體基本具有相同序列；固定所述抗體到固體支持物上以提供包含固定抗體的多個樣品；充分還原所述固定抗體的可還原二硫鍵以提供包含經還原固定抗體的多個樣品，其中所述還原對可還原二硫鍵有選擇性；還原的固定抗體與封端劑、藥物或藥物接頭和可選的檢測劑反應以提供包含固定抗體偶聯物的多個樣品，其中所述封端劑、藥物或藥物接頭和可選的檢測劑與活性巰基選擇性反應，所述封端劑、藥物或藥物接頭和可選的檢測劑以摩爾過量提供，并且選擇封端劑、藥物或藥物接頭和可選檢測劑的比率以實現所需藥物加載水平；洗脫所述抗體偶聯物以提供含游離抗體偶聯物的多個抗體偶聯物組合物；測試所述抗體偶聯物活性；和以試驗結果為基礎選擇抗體。在一些實施方式中，所述方法包含提供含有根據抗體數量和抗體序列不相同的樣品的多個抗體的步驟，前提是大部分的所述多個包含抗體的樣品中，單一樣品中出現的所有抗體基本具有相同序列；固定所述抗體到固體支持物上以提供包含固定抗體的多個樣品；充分還原所述固定抗體的可還原二硫鍵以提供包含經還原固定抗體的多個樣品，其中所述還原對可還原二硫鍵有選擇性；還原的固定抗體與封端劑和檢測劑反應以提供包含固定抗體偶聯物的多個樣品，其中所述封端劑和檢測劑與活性巰基選擇性反應，所述封端劑和檢測劑以摩爾過量提供，并且選擇封端劑和檢測劑的比率以實現所需檢測劑和/或封端劑加載水平；洗脫所述抗體偶聯物以提供含游離抗體偶聯物的多個抗體偶聯物組合物；測試所述抗體偶聯物活性；和以試驗結果為基礎選擇抗體。根據下面詳細描述、特定實施方式的非限定示例和附圖，可以更充分理解本專利技術的這些和其他方面。附圖簡要說明圖I.本圖提供鼠IgGl的疏水相互作用色譜圖，鼠IgGl采用其未偶聯形式(虛線)，充分還原和與溶液中的mcMMAF偶聯(重實線)，和固定在蛋白G瓊脂糖上時充分還原和與mcMMAF偶聯(輕實線)。圖2.本圖顯示在包含mcMMAF和需要的N-乙基-馬來酰亞胺的示例性反應混合物中mcMMAF的摩爾分數，以實現在蛋白G上固定和用過量三(2-羧基乙基)膦充分還原的鼠IgGl上選擇藥物加載。圖3.本圖提供抗體藥物偶聯物的樣品PLRP色譜圖，顯示抗體重鏈和輕鏈上mcMMAF和NEM的分布。藥物的疏水性造成有更多藥物種類的保留時間更晚；指示每個種類的藥物數目。圖4.本圖顯示藥物-Alexa Fluor 647偶聯物的熒光輸出作為熒光團加載函數。每個抗體的熒光團數目在X軸和熒光團在I軸作圖。當每個抗體加載約2. 5-3個熒光團時，熒光快速增加到最大值，然后隨著進一步加載而下降。 圖5.本圖提供650nm與280nm吸光度的比率作為混合的熒光團-mcMMAF抗體偶聯物中Alexa Fluor 647加載水平的本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：R·萊昂，D·本杰明，M·瑞安，
申請(專利權)人：西雅圖基因公司，
類型：
國別省市：