一種蛋白芯片及其制備方法并用其篩選單克隆抗體技術

本發明專利技術涉及一種蛋白芯片及其制備，并用其篩選單克隆抗體的靈敏方法，包括步驟：①用組織勻漿免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠；②取ＢＡＬＢ／ｃ小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞融合；③用流式細胞儀分離單個雜交瘤細胞，擴增培養；④制備蛋白芯片，用來鑒定產生的抗體，同時建立雜交瘤細胞庫；⑤制備篩選用蛋白芯片，用特異性抗原和多克隆抗體篩選對應的單克隆抗體。本發明專利技術用于單克隆抗體的大規模快速篩選。（*該技術在2020年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬分子生物學領域，涉及一種蛋白芯片及其制備方法，并用其來大規模快速地篩選單克隆抗體的靈敏的方法。單克隆抗體技術專利技術于1975年，其制備過程基本如下①用抗原免疫小鼠，②取小鼠的脾淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合，③雜交瘤細胞克隆化，④篩選特異的單克隆抗體。克隆化方法有①有限稀釋法，②軟瓊脂培養法，③單細胞顯微操作法，④單克隆細胞集團顯微操作法，⑤螢光激活細胞分類儀(流式細胞儀)分離法。經典的篩選特異性單克隆抗體的方法有①免疫酶技術、②免疫熒光技術、③放射免疫測定、④化學發光免疫分析、⑤間接凝血試驗。其中免疫酶技術用得最多，現以免疫酶技術的一種技術——間接酶聯免疫分析(ELISA)來說明篩選過程。用抗原包被載體，加入待測的單克隆化雜交瘤細胞的培養上清液，若上清液中有對應的單克隆抗體，則與包被的抗原結合；洗滌后再加入酶標記的第二抗體，形成固定化的抗原-抗體-酶標記的第二抗體復合物；依據底物顯色反應的強度，可對待測的單克隆抗體樣品進行定性或定量分析。經典的篩選特異性單克隆抗體的方法最大的缺點是得到的數個克隆中只能篩選出一種抗原的單克隆抗體、浪費大、效率低。應用蛋白芯片能快速檢測大量抗原抗體的結合反應。如果用組織勻漿免疫小鼠，把克隆化的雜交瘤細胞分泌的抗體固化到載體(通常為尼龍膜、硝酸纖維膜或玻片)上，用不同抗原和其多克隆抗體便可篩選到不同抗原的單克隆抗體的雜交瘤細胞株。從理論上講，如果克隆化的雜交瘤細胞庫足夠大，可篩選到所有蛋白質的單克隆抗體。經檢索提供的對比文獻及參考目錄附后。本專利技術的目的是專利技術一種蛋白芯片，通過其制備方法產生的蛋白芯片，能用于大規模快速地篩選單克隆抗體，方法簡單，成本低，并且同時建立雜交瘤細胞庫；本專利技術還涉及建立用特異性抗原和多克隆抗體篩選對應的單克隆抗體的方法。為了實現本專利技術的目的采取的方案①用組織勻漿免疫BALB/c小鼠；②取BALB/c小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞融合；③用流式細胞儀分離單個雜交瘤細胞，擴增培養；④制備蛋白芯片，用來鑒定產生的抗體，同時建立雜交瘤細胞庫；⑤制備篩選用蛋白芯片，用特異性抗原和多克隆抗體篩選對應的單克隆抗體。結合附圖對本專利技術進一步具體的說明所謂蛋白芯片即將大量特定的抗原(抗體)，有序地固化在載體上，載體可以是硝酸纖維素膜、尼龍膜或玻片等其它載體，利用抗原抗體的親和反應檢測對應的抗體(抗原)的陣列。本專利技術的流程和經典單克隆抗體制備的流程比較見圖1。圖中1為經典的雜交瘤抗體制備的流程圖，2為本專利技術流程圖，圖中本專利技術①-⑤為五個操作步驟為①用組織勻漿免疫BALB/c小鼠；②取BALB/c小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞融合；③用流式細胞儀分離單個雜交瘤細胞，擴增培養；④制備蛋白芯片，用來鑒定產生的抗體，同時建立雜交瘤細胞庫；⑤制備篩選用蛋白芯片，用特異性抗原和多克隆抗體篩選對應的單克隆抗體。圖1中3、組織勻漿 4、特種抗原5、脾細胞 6、雜交瘤細胞7、克隆 8、單克隆抗體 9、流式分離儀分離單個雜交瘤細胞10、蛋白芯片鑒定產生的抗體，建立雜交瘤細胞庫11、蛋白芯片篩選特異性單克隆抗體 12、融合13、骨髓瘤細胞。經典的制備方法也對應五個步驟，如圖1中以上所注。用蛋白芯片鑒定產生的抗體的原理見圖2。圖2中1、為蛋白芯片篩選特異性單克隆抗體的示意圖黑色圓點表示對應的孔有抗體產生；白色圓點表示無抗體產生，為啞克隆。2、為顯示無抗體產生時不顯色的原理，當克隆中無小鼠的抗體IgG(免疫球蛋白)時，FITC(異硫氰酸熒光素)標記的抗小鼠IgG抗體不能結合，在洗滌時洗去，對應點無熒光顯示。3、為顯示有抗體產生顯色的原理，當克隆中有小鼠的IgG抗體時，把雜交瘤細胞培養的上清液順序點印在玻片上，點印密度為1000點/cm2，IgG會被固化在玻片上特定的位置；用FITC標記的兔抗鼠IgG在玻片上孵育，有鼠IgG的點便會有熒光，通過此方法可方便去掉大量的啞克隆。4為有效抗體，5為無效抗體，6為FITC標記的小鼠IgG抗體。蛋白芯片篩選特異的抗體以AFP(甲胎球蛋白)為例，原理見圖3，把產生IgG抗體的克隆上清液點印在玻片上，點印密度為1000點/cm2，用AFP及標記FITC的免疫AFP多克隆抗體，在玻片上孵育，如果玻片上某點有AFP的單克隆抗體存在便會在激發光下產生熒光。圖3中，1為蛋白芯片篩選特異性單克隆抗體的結果示意圖，黑色表示陽性克隆，白色為陰性；2為無抗體不產生顯色原理圖，非特異性單克隆抗體不能識別特異性抗原，故不能形成特異性單克隆抗體-抗原-多克隆抗體-熒光復合物，故對應點無熒光；3為有抗體產生熒光顯色原理圖，特異性單克隆抗體能識別特異性抗原，故能形成特異性單克隆抗體-抗原-多克隆抗體-熒光復合物，故對應點有熒光；4為特異性抗體，5為非特異性抗體，6為FITC標記的特異性抗原的抗體。具體方法可細分為五部分1、用組織勻漿免疫BALB/c小鼠；2、取BALB/c小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞融合；3、用流式細胞儀分離單個雜交瘤細胞，擴增培養；4、制備蛋白芯片，用來鑒定產生的抗體，同時建立雜交瘤細胞庫；5、制備篩選用蛋白芯片，用特異性抗原和多克隆抗體篩選對應的單克隆抗體。1、用組織勻漿免疫BALB/c小鼠取2克組織(各種正常組織及腫瘤組織均可)制成勻漿，離心，去掉大的細胞碎片，按常規免疫。2、取BALB/c小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞融合取免疫BALB/c小鼠的脾細胞和適量的骨髓瘤細胞，用PEG(聚乙二醇)融合，融合后立即將細胞移入HAT培養液中，4-5天換HT培養液，6-7天后換普通培養液。3、用流式細胞儀分離單個雜交瘤細胞，擴增培養；收集融合雜交瘤細胞，并培養7-8天，制備成懸液；用流式細胞儀分離單個細胞，收集在384孔培養板中，培養孔中需預先加入培養液和飼養細胞(通常用小鼠腹腔巨噬細胞)；培養5天，檢測是否有抗體產生，培養8天再檢測一次。4、制備蛋白芯片，用來鑒定產生的抗體，同時建立雜交瘤細胞庫；①制備蛋白芯片取培養細胞的上清液，轉移到新的384孔板，用點樣器把培養的上清液點在玻片上形成1000點/cm2的陣列；(用不同的點樣器，點印的密度和上清液的體積不同)；每個點對應一個孔，每個點為0.2-1μl的上清液。IgG的濃度為1-100Pg/ml。②用制備的蛋白芯片鑒定產生的抗體，同時建立雜交瘤的細胞庫在蛋白芯片上加FITC標記的兔抗鼠IgG抗體(效價為1∶50-1∶1000)，37℃濕盒孵育30-60分鐘，用熒光顯微鏡觀察結果(也可用其它方法獲得圖像，如激光掃描儀)，③建立雜交瘤細胞庫在熒光顯微鏡下，挑選有熒光的點；標記對應的雜交瘤細胞孔，取適量細胞，擴增培養，液氮凍存細胞，建立雜交瘤細胞庫。蛋白芯片鑒定產生抗體的熒光顯微圖象見圖4，明亮斑點對應的雜交瘤產生抗體，否則為啞克隆。用FITC標記的兔抗鼠IgG只是一種鑒定方法，其它方法包括用熒光分子標記的其它抗小鼠IgG多克隆抗體，或者抗小鼠IgG多克隆抗體不標記，再偶聯熒光標記的第二抗體；另一種方法為先加入抗小鼠IgG多克隆抗體，偶聯生物素標記的第二抗體，再用熒光分子標記的親和素顯示熒光，以提高靈敏度。5、制備篩選用芯片，用特異性抗原和多克隆抗體篩選對應的單克隆抗體。①制備蛋白芯片用384孔板復蘇凍存細胞，本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種蛋白芯片，它是將大量特定的抗原或抗體，有序地固化在載體上，載體可以為硝酸纖維素膜、尼龍膜或玻片，利用抗原抗體的親和反應檢測對應的抗體或抗原的陣列，其特征是利用這種蛋白芯片可以大規模篩選單克隆抗體，是一種快速靈敏的篩選方法，具體分為五個步驟：①用組織勻漿免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠；②取ＢＡＬＢ／ｃ小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞融合；③用流式細胞儀分離單個雜交瘤細胞，擴增培養；④制備蛋白芯片，用來鑒定產生的抗體，同時建立雜交瘤細胞庫；⑤制備篩選用蛋白芯片，用特異性抗原 和多克隆抗體篩選對應的單克隆抗體；這樣的篩選流程。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳高明，
申請(專利權)人：陳學銀，
類型：發明
國別省市：11[中國|北京]