本發明專利技術涉及ＨＩＶ－１逆轉錄酶抑制劑的篩選方法，依據ＨＩＶ－１逆轉錄酶以單一堿基ＲＮＡ為模板催化ＤＮＡ合成，利用ｂｉｏｔｉｎ－ｄＵＴＰ和ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－ｄＵＴＰ隨機摻入ＤＮＡ中，形成ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－ｂｉｏｔｉｎ雙標記的ＤＮＡ；再通過抗ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ抗體特異性捕獲ＤＮＡ，利用熒光標記鏈親和素與ｂｉｏｔｉｎ標記ＤＮＡ的特異性結合進行檢測，根據熒光強弱可知合成ＤＮＡ中生物素的量，從而推算ＨＩＶ－１逆轉錄酶的活性。本發明專利技術克服了以往方法中生物素干擾造成假陽性的難題，對天然產物中的ＨＩＶ－１逆轉錄酶抑制活性進行高效、靈敏檢測，方法簡便，抗干擾能力強，在抗ＡＩＤＳ天然產物的篩選中具有廣泛應用前景。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種HIV-1逆轉錄酶抑制劑的篩選方法，具體說是其在天然產物粗提物中活性導向發現抗AIDS化合物方面的應用。
技術介紹
HIV-1逆轉錄酶(HIV-1 RT)抑制劑是獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)的潛在治療藥物，目前AIDS治療藥物的大部分是逆轉錄酶抑制劑。逆轉錄酶具有突出的靶點特異性，是當前AIDS治療藥物的研究熱點，發現新型、高效的HIV-1逆轉錄酶抑制劑極具應用價值。天然產物中蘊含種類繁多、結構新穎的化合物，是新藥的重要來源之一。目前對于天然產物的活性篩選大多集中于分離后獲得的純化合物的篩選，在這些純化合物中發現真正高活性物質的幾率很低，這是由于分離提取工作的盲目性導致的。活性導向分離提取有助于解決這個問題，提高工作效率。雖然HIV-1逆轉錄酶抑制劑抑制活性檢測方法檢測手段多樣，但局限于純化合物的逆轉錄酶抑制活性檢測。由于天然產物粗提物中含有大量內源性生物素的干擾，因此目前用于HIV-1逆轉錄酶抑制劑抑制活性檢測的方法無法用于粗提物的篩選，個別方法盡管影響較小，但由于操作復雜難以廣泛使用。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種操作簡單、可對粗提物進行HIV-1逆轉錄酶抑制活性跟蹤篩選抗AIDS天然產物的方法。方法原理HIV-1逆轉錄酶以RNA為模板催化DNA合成，在反應過程中生物素標記dUTP(biotin-dUTP)和digoxigenin標記dUTP(DIG-dUTP)隨機摻入DNA。HIV-1逆轉錄酶活性通過單位時間內摻入的biotin-dUTP體現，活性越高，單位時間內摻入的biotin-dUTP越多。合成的DNA通過摻入的DIG-dUTP捕獲到已包被抗digoxigenin抗體(anti-DIG)的孔板上。加入過量的BHHCT-Eu3+標記鏈親和素SA(BSA)0.9(BHHCT-Eu3+)46溶液后，標記鏈親和素和biotin-dUTP特異性結合，以時間分辨熒光模式測定結合的SA(BSA)0.9(BHHCT-Eu3+)46的熒光強度，得到HIV-1逆轉錄酶的活性。為實現上述目的，本專利技術采用的技術方案為一種用于活性導向篩選抗AIDS天然產物的方法，以HIV-1逆轉錄酶抑制活性的檢測來對天然產物粗提物進行活性篩選；具體為，將天然產物粗提物加入到HIV-1逆轉錄酶催化的以單一堿基組成的RNA為模板的DNA合成反應中，biotin標記dUTP和digoxigenin標記dUTP隨機摻入DNA，形成digoxigenin-biotin雙標記的DNA；再通過digoxigenin標記DNA與抗digoxigenin抗體的特異性結合進行捕獲，通過biotin標記DNA與熒光標記鏈親和素的特異性結合進行檢測，根據熒光強弱可知合成DNA中生物素的量，從而推算HIV-1逆轉錄酶的活性。HIV-1逆轉錄酶活性直接影響DNA的合成進而體現在單位時間內摻入的biotin-dUTP，最終以熒光強度檢測得到，HIV-1逆轉錄酶活性越高，單位時間內摻入的biotin-dUTP越多。本專利技術克服了以往方法中生物素干擾造成假陽性的難題。具體操作過程為1)將anti-DIG稀釋在PBS緩沖液中，配制終濃度為8～16mg/l的包被液；在96孔板中每孔加入60～100μ1包被液，包被18～36小時；2)用Tris-HCl緩沖液洗板，每孔用60～100μl 1～2％BSA封閉液封閉30～60分鐘；然后再用Tris-HCl緩沖液洗板；3)配制反應混合物0.5～1.0A260nm/ml模板/引物，0.1～10μM底物，0.1～10μM biotin-dUTP，0.1～10μM DIG-dUTP，45～50mM Tris，200～300mMKCl，20～30mM MgCl2，8～12mM DTT；4)將HIV-1RT稀釋在裂解緩沖液中，裂解緩沖液組成為45～50mMTris-HCl，pH 7～8，80～100mM KCl，1～5mM DTT，0.5～1.0mM EDTA，0.5～1.0％(v/v) Triton X-100，配制終濃度為50～100mU/μl HIV-1 RT溶液；5)將一定量的天然產物粗提物溶解在裂解緩沖液中；6)將20～40μl反應混合物、20～40μl天然產物粗提物溶液和20～40μlHIV-1 RT溶液加入到聚合酶鏈式反應管(PCR tube)內，在PCR儀上37℃逆轉錄反應20分鐘以上；7)將PCR tube中的混合物移入到包被、封閉好的板孔中，保鮮膜封板37℃孵育30～60分鐘；用Tris-HCl緩沖液洗板；8)每孔加入稀釋的BHHCT-Eu3+標記鏈親和素SA(BSA)0.9(BHHCT-Eu3+)46溶液60～100μl，保鮮膜封板37℃孵育1～2小時，其中鏈親和素濃度1～10μg/ml；用Tris-HCl緩沖液洗板，在時間分辨熒光免疫分析儀上檢測；以時間分辨熒光模式測定結合的SA(BSA)0.9(BHHCT-Eu3+)46的熒光強度，得到HIV-1逆轉錄酶的活性。步驟6)以20～40μl反應混合物、20～40μl裂解緩沖液進行逆轉錄反應，作為背景信號；以20～40μl反應混合物、20～40μl裂解緩沖液和20～40μl HIV-1 RT溶液，作為陽性對照。抑制率計算 本專利技術與現有技術相比具有如下優點1.本專利技術方法靈敏度、準確度與精密度高，抗生物素干擾能力強。2.應用范圍寬。本專利技術由于有效避免了內源性生物素帶來的干擾，可以用于天然產物粗提物的活性導向篩選，檢測粗提物的HIV-1 RT抑制活性，進而指導提取分離工作；可以準確定量實際樣品的HIV-1 RT活性，例如AIDS患者的血清；可以篩選純化合物的HIV-1 RT抑制活性，并確定其半數抑制濃度；由于使用了微量滴定板，配合自動化操作儀器和數據處理系統，即可用于高通量篩選。3.簡便省時。本專利技術操作步驟僅包括包被、封閉、逆轉錄反應、捕獲、標記物特異性結合和檢測，后四步僅需要約2.8小時，目前現有技術方法均超過4小時。4.應用方便。可根據本專利技術檢測方法開發出相應的檢測試劑和試劑盒，其應用將十分方便快捷。總之，本專利技術方法可對天然產物粗提物中的HIV-1逆轉錄酶抑制活性進行高效、靈敏檢測，方法簡便，抗干擾能力強，在抗AIDS天然產物的篩選和發現中具有廣泛應用前景。附圖說明圖1為不同HIV-1 RT濃度與背景扣除的熒光強度的關系曲線圖；注熒光計數(Fluorescence Counts)圖2為生物素對本專利技術方法在檢測已知抑制劑抑制HIV-1 RT活性時的干擾圖譜；圖3為摻入生物素對已知抑制劑抑制率的影響圖譜；圖4為本專利技術方法檢測繁茂膜海綿粗提物中添加已知抑制劑的效果圖譜；圖5為相同量的Efavirenz在空白和添加入繁茂膜海綿粗提物中的抑制率圖譜。具體實施例方式下面通過具體實施例對本專利技術的方法與結果進行說明，本專利技術使用銪熒光標記物BHHCT-Eu3+標記鏈親和素進行熒光定量測定，其中BHHCT-Eu3+是帶有生物標記功能的有機配位體與3價銪離子形成的熒光化合物，熒光測定方法包括常規的熒光測定法與時間分辨熒光測定法；其中BHHCT-Eu3+采用申請人已申報的專利制備(申請號03133857.7，專利技術名稱β-二酮-三價銪配合物納米熒光探針及其制本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種用于活性導向篩選抗ＡＩＤＳ天然產物的方法，其特征在于：以ＨＩＶ－１逆轉錄酶抑制劑抑制活性的檢測來對天然產物粗提物進行篩選；具體為，在逆轉錄反應體系中加入天然產物粗提物，逆轉錄反應體系包括ＨＩＶ－１逆轉錄酶、單一堿基組成的ＲＮＡ及引物、ｂｉｏｔｉｎ－ｄＵＴＰ、ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－ｄＵＴＰ、ｄＴＴＰ，ＨＩＶ－１逆轉錄酶以單一堿基組成的ＲＮＡ為模板催化ＤＮＡ合成，ｂｉｏｔｉｎ－ｄＵＴＰ和ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－ｄＵＴＰ隨機摻入ＤＮＡ，形成ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－ｂｉｏｔｉｎ雙標記的ＤＮＡ；再通過ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ標記ＤＮＡ與抗ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ抗體的特異性結合進行捕獲，通過ｂｉｏｔｉｎ標記ＤＮＡ與熒光標記鏈親和素的特異性結合進行檢測，ＨＩＶ－１逆轉錄酶活性通過單位時間內摻入的ｂｉｏｔｉｎ－ｄＵＴＰ體現，活性越高，單位時間內摻入的ｂｉｏｔｉｎ－ｄＵＴＰ越多。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：張衛，袁景利，胡政，靳艷，王桂蘭，虞星炬，金美芳，
申請(專利權)人：中國科學院大連化學物理研究所，
類型：發明
國別省市：91[中國|大連]
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