抗銅綠假單胞菌的I血清型脂多糖的抗體制造技術

本發明專利技術提供了一種具有對銅綠假單胞菌的優良抗細菌活性的新抗體。通過使用從患有慢性銅綠假單胞菌肺部感染的囊腫性纖維化患者中得到的成漿細胞作為起始材料，成功地得到了可與I血清型銅綠假單胞菌菌株的LPS結合并在體外和體內均具有優良抗細菌活性的抗體。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及抗銅綠假單胞菌的I血清型脂多糖的抗體及其應用。更具體地，本專利技術涉及特異性地結合銅綠假單胞菌菌株的I血清型脂多糖的抗體，以及包含任何所述抗體的藥物組合物、用于銅綠假單胞菌感染的診斷劑和銅綠假單胞菌檢測試劑盒。
技術介紹
銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一種廣泛且通常分布在自然環境中如土壌和水中的革蘭氏陰性需氧桿菌。銅綠假單胞菌是ー種無毒性細菌，其對于健康受試者通常是不致病的，所述健康受試者對于銅綠假單胞菌具有中等抗體效價和足夠的免疫功能。但是，一旦體弱患者感染了銅綠假單胞菌，銅綠假單胞菌可導致嚴重的癥狀，所述癥狀可導致所述患者死亡。為此，銅綠假單胞菌作為醫院感染和機會感染的主要病原菌已引起關注，因此銅綠假單胞菌感染的預防和治療在醫學領域已是重要的問題。 對于銅綠假單胞菌感染的預防或治療，主要使用抗生素或合成抗細菌劑。但是，銅綠假單胞菌對這些藥物產生抗性，因此這些藥物在許多情況下無法提供足夠的治療效果。特別地，使用抗生素等治療耐多藥銅綠假單胞菌(MDRP)的感染很困難，并且有限制。為此，作為其替代方法，已開始使用免疫球蛋白制劑的治療。同吋，也檢驗了使用抗銅綠假單胞菌的抗體預防或治療銅綠假單胞菌感染。例如，已開發了抗體，其各自特異性地結合具體血清型銅綠假單胞菌菌株上(專利文獻I至5，非專利文獻I和2)。但是，目前開發的抗銅綠假單胞菌的抗體在銅綠假單胞菌感染的預防或治療中尚未提供足夠的效果。引文列表專利文獻專利文獻I日本未審查專利申請公開文本No. Hei 6-178688專利文獻2日本未審查專利申請公開文本No. Hei 6-178689專利文獻3日本未審查專利申請公開文本No. Hei 7-327677專利文獻4國際公開文本No. WO 2004/101622 專利文獻5國際公開文本No. WO 2006/084758非專利文獻非專利文獻I The Journal of Infectious Diseases, 152，6，1985，1290-1299。非專利文獻2 Journal of General Microbiology, 133，1987，3581-3590。
技術實現思路
技術問題考慮到上述情況而作出本專利技術，并且本專利技術的目的是提供ー種具有對銅綠假單胞菌的優良抗細菌活性的新抗體。本專利技術的ー個主要目的是提供ー種對銅綠假單胞菌具有優良的抗細菌活性并且可用作多克隆抗體制劑的組分的新抗體。作為這種新抗體的ー個方面，本專利技術的目的是提供一種特異性地結合銅綠假單胞菌菌株的I血清型脂多糖的抗體。技術方案為達到上述目的，本專利技術人采用了以下方法。首先，從患有慢性銅綠假單胞菌肺部感染的囊腫性纖維化患者和健康志愿者中采集血液樣本。將具有高比例的對于脂多糖(下文中有時簡稱為“LPS”)具有特異性的成漿細胞的供體樣本通過以下方法進行鑒定(I)測定在循環血液中成漿細胞和漿細胞的量的FACS分析；(2)測定在循環血液中產生對具體LPS抗原具有特異性的抗體的細胞的量的ELISP0T分析；以及(3)測定對具體LPS抗原具有特異性的免疫球蛋白存在或不存在的ELISA分析。然后，從由此鑒定的供體樣本制備識別LPS的抗體。 具體地，通過染色⑶19、⑶38、A輕鏈和死細胞來選擇活成漿細胞。在選出的成漿細胞上，來源于相同的B細胞的編碼重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)的DNA序列通過兩步PCR——包括多重重疊延伸RT-PCR和隨后的巢式PCR——而配對(圖I)。隨后，將擴增DNA插入到篩選載體中,然后轉化到大腸桿菌(Escherichia coli)中。從所述大腸桿菌中純化出擴增載體集合。將所得的抗體庫在動物培養細胞中表達。通過ELISA篩選編碼可結合純化的LPS分子的抗體的克隆體，并選擇LPS特異性克隆。然后，測定所選克隆的堿基序列。其后，檢測由如此得到的克隆編碼的抗體的多種活性、其血清型特異性和抗原表位。結果，發現了鑒定的抗體可結合銅綠假單胞菌的I血清型LPS，且在體外和體內具有優良的抗細菌活性。具體地，本專利技術涉及可結合銅綠假單胞菌的I血清型LPS的抗體，展現出優良的抗細菌活性。本專利技術還涉及所述抗體的用途。更具體地，本專利技術提供了 ー種抗體，其可識別銅綠假單胞菌的脂多糖的B帶LPS，且其實質上可與I血清型的銅綠假單胞菌菌株的表面結合，但實質上不與A、B、E、G和M血清型銅綠假單胞菌菌株的任一表面結合。根據第I條所述的抗體，其具有對I血清型的銅綠假單胞菌菌株的調理素活性。根據第2條所述的抗體，其中對由ATCC 27586標識的銅綠假單胞菌菌株的調理素活性的EC50為0. 5 ii g/ml或更小。根據第I至3條的任一項所述的抗體，其具有對I血清型的銅綠假單胞菌菌株的凝集活性。根據第4條所述的抗體，其中對由ATCC 27586標識的銅綠假單胞菌菌株的單位量(U g) IgG的凝集效價為20或更大。根據第I至5條的任一項所述的抗體，其對I血清型的銅綠假單胞菌菌株的全身性感染具有抗細菌作用。根據第6條所述的抗體，其中對全身性感染由ATCC 27586標識的銅綠假單胞菌菌株的中性粒細胞減少癥小鼠模型的抗細菌作用的ED50不大于青霉酮(Venilon)的抗細菌作用的ED50的1/100。具有以下特征(a)至(f)的任ー項的抗體(a)包含輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO: I至3所示的氨基酸序列或在其至少ー個序列中一個或多個氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ IDNO: I至3所示的氨基酸序列，和重鏈可變區，其包括SEQ ID N0:4至6所示的氨基酸序列或在其至少ー個序列中一個或多個氨基酸被置換、刪除、加入和/或插入的SEQ IDN0:4至6所示的氨基酸序列；(b)包含輕鏈可變區，其包括SEQ ID N0:9至11所示的氨基酸序列或在其至少ー個序列中一個或多個氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ IDN0:9至11所示的氨基酸序列，和重鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 12至14所示的氨基酸序列或在其至少ー個序列中一個或多個氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQID NO: 12至14所示的氨基酸序列；(C)包含 輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO: 17至19所示的氨基酸序列或在其至少ー個序列中一個或多個氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQID NO: 17至19所示的氨基酸序列，和重鏈可變區，其包括SEQ ID NO:20至22所示的氨基酸序列或在其至少ー個序列中一個或多個氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQID NO:20至22所示的氨基酸序列；(d)包含輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO:25至27所示的氨基酸序列或在其至少ー個序列中一個或多個氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQID NO:25至27所示的氨基酸序列，和重鏈可變區，其包括SEQ ID NO:28至30所示的氨基酸序列或在其至少ー個序列中一個或多個氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQID NO:28至30所示的氨基酸序列；(e)包含輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO:33至35所示的氨基酸序列或在其至少ー個序列中一個或多個氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQID本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：田中二朗，P·S·安德森，奧富隆文，稻葉常良，大冢圭子，赤羽宏友，星名由佳利，長曽宏，熊谷正志，
申請(專利權)人：明治制果藥業株式會社，西福根有限公司，
類型：
國別省市：