鈉/鉀三磷酸腺苷酶及膽固醇相關的材料和方法技術

本發明專利技術部分基于鈉/鉀三磷酸腺苷合成酶(Na/K?ATPase)的新結構構象及功能的闡明,尤其是對新的結合位點及相互作用的闡明。本發明專利技術提供了Na/K?ATPase及與Na/K?ATPase相互作用的化合物之間的數種驚人的結構及功能關系的應用。這些結構和關系的公開提供了對在化學上影響Na/K?ATPase相互作用以及已知的其上游和下游的調節子的理解及解決方案。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及生物學、化學及醫學領域。本專利技術具體涉及與心血管疾病相關的離子轉運蛋白質、小的藥物活性分子、研究工具、診斷學、試劑盒及處理方法。影響膽固醇介導的心血管疾病的強心類固醇拮抗劑及組合物在本專利
內。其他領域，如物理學及生物化學也為本專利技術提供了框架。
技術介紹
本專利技術部分基于對鈉/鉀三磷酸腺苷合成酶(Na/K ATPase)的新結構構象及功能的闡明，尤其是對新的結合位點及相互作用的闡明。本專利技術提供了 Na/K ATPase及與Na/KATPase相互作用的化合物之間的驚人的結構及功能關系的應用。本專利技術提供了解決方案，其在化學上影響了 Na/K ATPase相互作用以及已知的上游和下游的調節子。Na/K-ATPase起初是作為位于質膜內的活性離子轉運子發現的。功能性的Na/K-ATPase主要是由α和β亞基構成。α亞基為催化亞基，因為其包含配體及核苷酸結合位點。盡管其長期以離子轉運子為人所知，近期的研究表明Na/K-ATPase除了其離子泵功能外，還能夠進行多種其他功能。例如,發現Na/K-ATPase與Src激酶相互作用，形成功能性信號傳導復合物，能夠將細胞外信號轉導進入而激活細胞內激酶級聯。有趣的是，證明了進行信號傳導的Na/K-ATPase主要位于專門的質膜微結構域(稱為穴樣內陷(“小窩”))并與穴樣內陷標記物——窖蛋白-I蛋白質相互作用。窖蛋白-I蛋白質是一種 22-kD蛋白質，主要位于質膜中。除了其在穴樣內陷的生物形成中的作用外，已知其在細胞膽固醇體內平衡中起作用。已經證明其與膽固醇以1:1的比率相結合，并參與膽固醇在質膜和細胞內細胞器之間的運輸。進一步地，細胞膽固醇的耗盡使得窖蛋白-I重新分配至核周區域。在另一方面，Na/K-ATPase調控窖蛋白-I的細胞膜運輸。Na/K-ATPase α I的梯度敲除導致窖蛋白-I在穴樣內陷結構域內移動，并使得窖蛋白-I重新分配至核周區域。細胞膽固醇的耗盡使得Na/K-ATPase α I重新分配到穴樣內陷之外。專利技術概述在其他廣泛的實施方式中，提供了鑒定能夠調制細胞內膽固醇濃度的測試組合物的方法，包括a.在膽固醇運輸測試模型中將測試組合物與Na/K ATPase相接觸；以及b.鑒定步驟a.是否產生細胞內膽固醇濃度的調制。還提供了鑒定能夠調制質膜膽固醇濃度的測試組合物的方法，包括a.在膽固醇運輸測試模型中將測試組合物與Na/K ATPase相接觸；以及b.鑒定步驟a.是否產生細胞內膽固醇濃度的調制。優選的是上述權利要求的任何項，其中調制為細胞內膽固醇濃度的降低，其中測試模型為細胞培養物，其中測試模型為哺乳動物的，其中測試模型選自肝細胞；腎細胞；腦細胞；神經細胞；胰腺細胞；肺細胞；皮膚細胞；心臟細胞；嚙齒動物細胞；人細胞；小鼠；大鼠；豚鼠；猴；以及人，其中測試模型選自以下的測試模型=NPCl病；病理性脂質積累；脈管疾病；心臟病；中風；超重；肥胖；糖尿病；代謝綜合征；甲狀腺功能紊亂；藥物副作用；關節硬化；心力衰竭；心臟疾病；阿爾茨海默病；帕金森病；亨廷頓病；泰薩二氏病；以及神經退行性疾病。·還提供了鑒定能夠調制膽固醇濃度的測試組合物的方法，包括a.將測試組合物與Na/K ATPase相接觸；以及b.鑒定步驟a.是否產生對Na/K ATPase的α I亞基的CRAC結構域的結合。優選的那些方法中，步驟a.是以選自體外和體內的形式完成的。還提供了影響細胞中膽固醇轉運的方法，包括影響Na/K ATPase的膽固醇結合活性。優選的是那些方法，其中Na/K ATPase的膽固醇結合活性以以下方式受到影響降低；增加；消除；階段性破壞；以及階段性增強。還提供了在需要這種改善的器官中改善由于病理性細胞內膽固醇累積導致的神經退行的方法,包括降低Na/K ATPase的膽固醇結合活性。還提供了治療Cl型Neumann Pick病的方法,包括專門降低Na/K ATPase結合膽固醇的能力，其中降低是以選自以下的方式完成的拮抗Na/K ATPase的α I亞基的CRAC結構域；以及抑制Na/K ATPase的α I亞基的CRAC結構域。還提供了鑒定能夠治療膽固醇相關疾病狀態的組合物的方法，包括a.將測試組合物與Na/K ATPase相接觸；以及b.鑒定步驟a.是否產生對膽固醇結合Na/K ATPase的α I亞基的CRAC結構域的能力的拮抗。優選的是所描述的那些方法，其中疾病狀態選自NPCl ;病理性脂質積累；脈管疾病；心臟病；中風；超重；肥胖；糖尿病；代謝綜合征；甲狀腺功能紊亂；藥物副作用；關節硬化 ’心力衰竭;心臟疾病；阿爾茨海默病；帕金森病；亨廷頓病；泰薩二氏病；以及神經退行性疾病。還提供了在膽固醇運輸測試模型中下調Na/K ATPase的方法，包括在測試模型中耗盡質膜膽固醇濃度。還提供了在膽固醇運輸測試模型中將Na/K ATPase的α I亞基重新分配到細胞內區室的方法，包括在測試模型中耗盡質膜膽固醇濃度。還提供了在膽固醇運輸測試模型中影響窖蛋白-I的運輸和表達的方法，包括下調質膜的Na/K ATPase的α I亞基。還提供了治療NPCl病的方法，包括改變Na/K ATPase的α I亞基的表達，以改善NPCl病的癥狀。本領域技術人員在參考附隨的圖示并閱讀以下優選實施方式的詳述本專利技術的多個方面后將清楚本專利技術的多個方面。附圖簡述本專利或申請文件可以包含一個或多個彩色圖片及/或一張或多張照片。帶有彩色圖片及/或照片的本專利或專利申請出版物的副本將由美國專利商標局在收到請求及必要的支付費用時進行提供。圖I. Μβ -⑶引起的膜膽固醇的急性耗盡下調了 Na/K-ATPase α I。在無血清培養基中用IOmM M β-⑶處理LLC-PKl細胞，在37°C進行lh，洗滌，并在洗滌后的細胞于無血清培養基中培養0、6和24h后收集細胞。附圖說明圖1A.測量不同時間點的細胞裂解物中膽固醇含量，根據蛋白質水平進行調整并比較。圖1B.代表性的Western印跡顯示了 Na/K-ATPase α I、胰島素受體β亞基及α-微管蛋白(用作上樣對照)的水平。結合四次獨立的實驗得出定量數據，表示為平均值土SE. *，Ρ〈0. 05。圖1C.顯示了未處理細胞及Μβ-⑶處理的細胞中Na/K-ATPase α I的細胞內分布的代表性共聚焦圖像。圖2.慢性膽固醇耗盡下調了 Na/K-ATPase α I。將LLC-PK1細胞在含有10%FBS(對照)或10%無血清或10%無脂蛋白FBS的DMEM中培養48h，裂解并測量α I亞基以及α -微管蛋白，如圖2Α的圖所示，膽固醇情況在圖2Β中顯示。結合四次獨立的實驗得出定量數據，表示為平均值土 SE. *，Ρ〈0. 05。圖3.化合物U18666A耗盡質膜膽固醇并特異性下調Na/K-ATPase α I。圖3Α.將LLC-PKl細胞以不同劑量的U18666A處理24h，然后進行菲律賓菌素處理(上圖)及α I免疫染色(下圖)。代表性的圖片顯示了 U18666A化合物對膽固醇及Na/K-ATPase α I的細胞分配的劑量依賴性影響。圖3Β.三次獨立實驗的代表性Western印跡顯示了細胞處理48h后，U18666A對Na/K-ATPase α 本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：謝子建，陳逸良，王浩杰，
申請(專利權)人：托萊多大學，
類型：
國別省市：