本發(fā)明專利技術(shù)公開(kāi)了一種人miR-183/96/182簇的應(yīng)用方法及其檢測(cè)試劑盒，其用于制備腦膠質(zhì)瘤診斷、預(yù)測(cè)、檢測(cè)或篩查制劑；特別是提供了一種用于制備腦膠質(zhì)瘤診斷、預(yù)測(cè)、檢測(cè)或篩查的試劑盒。該試劑盒通過(guò)相對(duì)定量的檢測(cè)疑似腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中miR-183/96/182簇中三個(gè)miRNA的表達(dá)狀況，用于腦膠質(zhì)瘤病人預(yù)后預(yù)測(cè)。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及人miR-183/96/182簇的應(yīng)用方法，以及一種腦膠質(zhì)瘤診斷試劑盒。
技術(shù)介紹
腦膠質(zhì)瘤是起源于腦部神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，是最常見(jiàn)的顱內(nèi)腫瘤，約占所有顱內(nèi)腫瘤的45%左右。腦膠質(zhì)瘤系浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，和正常腦組織沒(méi)有明顯界限，難以完全切除，對(duì)放療化療不甚敏感，非常容易復(fù)發(fā)。化學(xué)藥物和一般抗腫瘤的中藥，因血腦屏障等因素的影響， 療效也不理想，迄今為止腦膠質(zhì)瘤仍是全身腫瘤中預(yù)后最差的腫瘤之一，因此腦膠質(zhì)瘤的基礎(chǔ)研究和臨床治療仍然是世界難題。miRNA是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長(zhǎng)約19 25個(gè)核苷酸。其主要通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式識(shí)別靶mRNA，并根據(jù)互補(bǔ)程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。 miRNA與蛋白編碼基因一樣，具有主要的生物學(xué)功能，大多數(shù)miRNA在腫瘤中發(fā)揮主要功能作用，有望成為腫瘤新的判定預(yù)后標(biāo)志物和靶向治療的工具，為人類戰(zhàn)勝腦膠質(zhì)瘤提供新的策略。全基因組水平非編碼DNA序列的研究發(fā)現(xiàn)，有相當(dāng)一部分miRNA基因在染色體上的分布是非隨機(jī)的，它們緊密相鄰，排列成簇。miRNA簇一般有幾個(gè)miRNA組成，miRNA簇的表達(dá)異常參與機(jī)體的生理、病理過(guò)程。miR-106b-25簇中的3個(gè)miRNA成員在頭頸部鱗癌、 結(jié)腸癌、髓母細(xì)胞瘤、食管癌、多發(fā)性骨髓瘤、肝癌等多種腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞株中都高表達(dá)。研究表明，miR-17-92簇的異常高表達(dá)能通過(guò)降低腫瘤抑制蛋白PTEN的水平而促進(jìn)淋巴瘤和白血病生長(zhǎng)和存活，同時(shí)還能夠抑制Rb蛋白促進(jìn)成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤的生長(zhǎng)增殖。由此可見(jiàn)，miRNA簇在探尋腫瘤分子標(biāo)志物方面具有巨大潛力，相信在不久的將來(lái)，miRNA簇將會(huì)大大促進(jìn)在腫瘤病人預(yù)后預(yù)測(cè)中的應(yīng)用。研究表明，miRNA簇中的個(gè)體之間可能以協(xié)同方式參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，miR-17-92簇中miR-17、miR_18a、miR_19a、 miR-20a、miR-19b、miR-9^i在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中呈現(xiàn)協(xié)同作用，且與腫瘤的預(yù)后相關(guān)， 同時(shí)miR-17與miR-9h有望成為判定結(jié)腸癌預(yù)后的分子標(biāo)志物。臨床上常采用多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)，應(yīng)用多變量分析的方法來(lái)提高診斷的陽(yáng)性率和特異性。不少證據(jù)表明，同一腫瘤可含有多種腫瘤標(biāo)志物，而不同腫瘤或同種腫瘤的不同組織類型，除有共同的標(biāo)志物外，也可有不同的標(biāo)志物。對(duì)某一特定的腫瘤測(cè)定，可同時(shí)選擇幾種特異性較高的標(biāo)志物， 互相補(bǔ)充，提高診斷的陽(yáng)性率。在大腸癌的腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)中，癌胚抗原是最常用于大腸癌的腫瘤標(biāo)志物。尤其常用于對(duì)大腸癌的治療效果及預(yù)后、復(fù)發(fā)的監(jiān)測(cè)。但由于癌胚抗原的特異性、靈敏性有限，常需聯(lián)合檢測(cè)CA19-9、CA50等腫瘤標(biāo)志物，以提高診斷準(zhǔn)確性。最近研究表明，miR-182在膠質(zhì)瘤組織表達(dá)顯著升高，其表達(dá)越高，膠質(zhì)瘤患者預(yù)后越差。miR-182 與miR-183、miR-96呈簇排列，聯(lián)合檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織中的miR-183/96/182有望為膠質(zhì)瘤臨床提供更準(zhǔn)確的診斷與預(yù)后判定
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一種人miR-183/96/182簇在制備腦膠質(zhì)瘤診斷、預(yù)測(cè)、檢測(cè)或篩查制劑上的應(yīng)用方法，并提供一種性價(jià)比高、易于推廣應(yīng)用的腦膠質(zhì)瘤診斷試劑盒。人miR-183/96/182簇用于制備腦膠質(zhì)瘤診斷、預(yù)測(cè)、檢測(cè)或篩查制劑；所述的 miR-183/96/182簇包括miR-183、miR-96和miR-182 ；特別是用于制備腦膠質(zhì)瘤診斷、預(yù)測(cè)、 檢測(cè)或篩查的試劑盒。人腦膠質(zhì)瘤診斷試劑盒，包括l)Trizol、三氯甲烷、異丙醇；2) DEPC水或無(wú)酶水；3)逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、氯化鎂、三磷酸堿基脫氧核苷酸、RNA酶抑制劑； 4) MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶或AMV酶；5) miR-183、miR-96、miR-182以及內(nèi)參U6SNRNA的特異性逆轉(zhuǎn)錄引物；6)實(shí)時(shí)定量PCR緩沖液、miR-183、miR_96、miR-182以及內(nèi)參U6SNRNA的實(shí)時(shí)定量特異性PCR引物；7) SYBR-Green染料、Taq聚合酶、雙蒸水。miR-183的實(shí)時(shí)定量特異性PCR引物，其正向引物為5 ‘ -CGAACGATATGGCACTGGTAGA 3 ‘，其反向引物為5' -TATGGTTGTTCTCGTCTCCTTCTC-3‘。miR-96的實(shí)時(shí)定量特異性PCR引物，其正向引物為5 ‘ -CGAACTTTGGCACTAGCACATT-3 ‘，其反向引物為5 ‘ -TATGGTTGTTCTCGTCTCCTTCTC-3 ‘。miR-182的實(shí)時(shí)定量特異性PCR引物，其正向引物為5 ‘ -ACTTTTGGCAATGGTAGAACTCAC-3 ‘，其反向引物為5 ‘ -AATCCATGAGAGATCCCTAGCG-3 ‘。TOsnRNA的實(shí)時(shí)定量特異性PCR引物，其正向引物為5 ‘ -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3 ‘其反向引物為5 ‘ -GGAACGCTTCACGAATT TG-3 ‘。miR-183/96/182 簇包括 miR-183 (miRBase 登錄號(hào)MI0000273)、miR-96 (miRBase 登錄號(hào)MI0000098) ,miR-182 (miRBase 登錄號(hào)MI0000272)，位于染色體 7q32. 2，屬于基因間miRNA。申請(qǐng)人首先通過(guò)原位雜交檢測(cè)M例正常大腦組織和66例腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-183/96/182簇中三個(gè)miRNA在腦膠質(zhì)瘤組織中均呈現(xiàn)高表達(dá)(圖1)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，miR-183、miR-96、miR-182在66例腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)陽(yáng)性率分別為84. 85%, 87. 88%,96. 97% ；而miR-183、miR-96、miR-182在24例正常大腦組織中表達(dá)陽(yáng)性率分別為16. 67%、16. 67%,8. 3%0 miR-183/96/182簇中三個(gè)miRNA在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)陽(yáng)性率與正常大腦組織比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是目前檢測(cè)組織miRNA表達(dá)中權(quán)威的檢測(cè)方法之一。為了更好地判定miR-183/96/182簇在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況，申請(qǐng)人運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)，miR-183/96/182簇中三個(gè)miRNA 在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)均上調(diào)，與正常大腦組織比，miR-183、miR-96、miR-182分別上調(diào) 3. 34士0. 64,3. 67士0. 71,3. 83士0. 68 倍(圖 2)。隨訪資料顯示，miR-183/96/182簇中miR-183高表達(dá)的33例腦膠質(zhì)瘤病人中4有20例死亡，而miR-183低表達(dá)的33例腦膠質(zhì)瘤病人中僅有6例死亡；miR-96高表達(dá)的35例腦膠質(zhì)瘤病人中死亡21例，而miR-96低表達(dá)的35例腦膠質(zhì)瘤病人中僅有5例死亡；miR-182高表達(dá)的34例腦膠質(zhì)瘤病人中有22例死亡，而miR-182低表達(dá)32例腦膠質(zhì)瘤病人中僅有4例死亡；經(jīng)Kaplan-Meier統(tǒng)計(jì)學(xué)分析miR-183/96/182簇中單個(gè)miRNA高表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤病人總生存率均低于單個(gè)miRNA低表達(dá)的病人，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 01)(圖3)，本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
【技術(shù)特征摘要】
1.人miR-183/96/182簇的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的人miR-183/96/182簇用于制備腦膠質(zhì)瘤診斷、預(yù)測(cè)、檢測(cè)或篩查制劑；所述的miR-183/96/182簇包括miR-183、miR-96 和 miR-182。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的人miR-183/96/182簇用于制備腦膠質(zhì)瘤診斷、預(yù)測(cè)、檢測(cè)或篩查的試劑盒。3.一種人腦膠質(zhì)瘤診斷試劑盒，其特征在于，包括1)Trizol、三氯甲烷、異丙醇；2)DEPC水或無(wú)酶水；3)逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、氯化鎂、三磷酸堿基脫氧核苷酸、RNA酶抑制劑；4)MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶或AMV酶；5)miR-183、miR-96、miR-182以及內(nèi)參U6SNRNA的特異性逆轉(zhuǎn)錄引物；6)實(shí)時(shí)定量PCR緩沖液、miR-183、miR-96、miR-182以及內(nèi)參U6SNRNA的實(shí)時(shí)定量特異性PCR引物；7)SYBR-Green染料、Taq聚合酶、雙蒸水。4.根...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：武明花，唐海林，劉曉萍，鄧敏，王澤友，徐剛，李桂源，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中南大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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