一株耐酸酵母及其代謝工程構(gòu)建產(chǎn)L-乳酸重組菌的方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明專利技術(shù)篩選分離得到一株能在pH2.5條件下生長(zhǎng)且不利用乳酸的酵母，鑒定為木蘭假絲酵母C4(CandidamagnoliaeC4)，在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CCTCCNO：M2010362；將來源于米根霉As3.819的乳酸脫氫酶編碼基因(ldhA)插入含有G418抗性基因的酵母穿梭載體，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pYX212-kanMX-ldhA；電轉(zhuǎn)化入木蘭假絲酵母C4中，得到一株具有產(chǎn)L-乳酸能力的重組菌株木蘭假絲酵母C42，其產(chǎn)乳酸量達(dá)到42g/L。本發(fā)明專利技術(shù)所構(gòu)建的木蘭假絲酵母C42具有耐乳酸的明顯優(yōu)勢(shì)，在生產(chǎn)中可以大幅度降低中和劑CaCO3的用量，減少環(huán)境污染。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一株耐酸酵母的篩選，以及產(chǎn)L-乳酸重組菌的構(gòu)建方法，屬于基因工程
技術(shù)介紹
乳酸(Lactic acid)是一種重要的有機(jī)酸，廣泛地存在于人體、動(dòng)物、植物和微生物中。乳酸因其安全性、光學(xué)特性及其特殊的分子結(jié)構(gòu)被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品等工業(yè)。乳酸分子內(nèi)含有一個(gè)不對(duì)稱的C原子，存在光學(xué)異構(gòu)現(xiàn)象，具有D-型和L-型兩種。由于人體只能利用L (+)-乳酸，因此世界衛(wèi)生組織提倡在食品及醫(yī)藥行業(yè)使用L (+)-乳酸取代目前普遍使用的DL (+)-乳酸；另外L-乳酸的一個(gè)重要用途為合成聚乳酸，聚乳酸因可以由可再生資源生產(chǎn)并能被生物所降解而被認(rèn)為是最有發(fā)展前景的聚合物之一。L-乳酸的主要生產(chǎn)方法為微生物發(fā)酵法。現(xiàn)國(guó)內(nèi)外研究的L-乳酸生產(chǎn)菌主要集中在乳桿菌、Lac tobacillus )、芽孢桿菌(Macillus )、乳球菌Uac tococcus )和根霉 0%辦0/7狀)。在乳酸發(fā)酵過程中，pH值會(huì)隨著乳酸的生成而逐漸降低，由于細(xì)菌和根霉菌耐酸性較差，當(dāng)發(fā)酵液處于酸性時(shí)將影響菌株的生長(zhǎng)和發(fā)酵能力。因此，工業(yè)上乳酸發(fā)酵過程常采用CaCO3作為中和劑，以維持最適pH值。但是乳酸鈣結(jié)晶細(xì)小，結(jié)晶過程不易控制， 30%乳酸鈣殘留在結(jié)晶母液中，不能結(jié)晶出來，大量的副產(chǎn)物(石膏)會(huì)造成環(huán)境污染，成為乳酸生產(chǎn)企業(yè)三廢處理的關(guān)鍵點(diǎn)和難點(diǎn)。相對(duì)于細(xì)菌和霉菌，酵母菌具有更好的耐酸特性，因此國(guó)內(nèi)外研究者將研究重點(diǎn)逐漸轉(zhuǎn)為利用基因工程方法改造遺傳背景清晰的釀酒酵母，使其能夠生產(chǎn)乳酸。雖然重組菌株在較高的酸性條件下能夠生存和生長(zhǎng)，但產(chǎn)乳酸能力普遍不強(qiáng)。Adachi E等人研究的重組產(chǎn)乳酸酵母在PH 3. 5時(shí)乳酸的最終產(chǎn)量?jī)H為在pH 4. 5時(shí)的60%(Adachi Ε, Torigoe Μ, Sugiyama Μ, et al. Modification of metabolic pathways of Saccharotnyces cerevisiae by the expression of lactate dehydrogenase and deletion of pyruvate decarboxylase genes for the lactic acid fermentation at low pH value. J Ferment Bioeng, 1998，86(3) : 284-289. )0之后，Skory CD所研究構(gòu)建的重組產(chǎn)乳酸酵母的最適PH值為5.0，當(dāng)發(fā)酵液pH值低于5. O時(shí)，乳酸產(chǎn)量將有所降低(Skory CD. Lactic acid production by Saccharomyces cerevisiae expressing a Rhizopus oryzae lactate dehydrogenase gene. J Ind Microbiol Biotechnol (2003) 30: 22 - 27.)。因此后來研究者在利用重組產(chǎn)乳酸酵母進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，在發(fā)酵液中還是需要加入一定量的中和劑調(diào)節(jié)發(fā)酵液PH值。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是為克服上述乳酸生產(chǎn)菌耐酸性不強(qiáng)的缺點(diǎn)，篩選出一株耐高濃乳酸且不利用乳酸的耐酸酵母菌株，在此基礎(chǔ)上通過代謝工程改造，增加該菌株的乳酸代謝途徑，使其能夠在較低PH值下正常發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸。為實(shí)現(xiàn)本專利技術(shù)的目的，本專利技術(shù)所采用的技術(shù)方案為一株能夠在以乳酸調(diào)節(jié)PH到2. 5的培養(yǎng)環(huán)境中生長(zhǎng)但不利用乳酸的菌株，命名為木蘭假絲酵母C4 {Candida magnoliae C4)，已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為 CCTCC NO :M2010362。一株木蘭假絲酵母C42 {Candida magnoliae C42)，其為對(duì)所述的木蘭假絲酵母 C4進(jìn)行基因重組，獲得木蘭假絲酵母C42具有在低pH條件下發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的性能。所述的木蘭假絲酵母C42，在于將來源于米根霉As3. 819的乳酸脫氫酶編碼基因 IdhA插入含有G418抗性基因的酵母穿梭載體，構(gòu)建了重組質(zhì)粒p^(212-h/7MX-A/AA，并電轉(zhuǎn)化入木蘭假絲酵母C4中，得到木蘭假絲酵母C42。( 1)耐酸酵母菌株的篩選稱取5 g自然樣品(采集自無錫市太湖邊的土樣)，加至含100 mL無菌生理鹽水及玻璃珠的三角瓶中，在30°C下，150 r/min振蕩打散30 min ；樣品懸液用無菌生理鹽水進(jìn)行系列稀釋，選擇適合的稀釋度，分別涂布于YEPD平板，30°C培養(yǎng)5 7 d，觀察菌落生長(zhǎng)情況，并將新長(zhǎng)出的形態(tài)上有差異的單菌落挑出。從分離得到的單菌落中挑取典型的酵母菌落分別接種于以乳酸調(diào)節(jié)PH值至4的YEPD液體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)48 h。選擇生長(zhǎng)較好的酵母菌株依次接入含有93.5 g/L乳酸的篩選培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h，選擇出長(zhǎng)勢(shì)最好一株耐酸酵母，命名為C4。通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，此耐酸酵母的分類地位屬于木蘭假絲酵母 Candida magnoliae {C. magnoliae)，在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CCTCC NO :M 2010362。(2)米根霉As3. 819的乳酸脫氫酶編碼基因、lcM)的獲得提取米根霉As3. 819的染色體DNA，以其為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用引物如下 Rl 5' -CGCGGATCCATGGTATT ACACTCA-3‘ R2 5' -CCGAAGCTTTCAACAGCTACTTTTA-3‘PCR方法如下50 “1^反應(yīng)體系中加入1011111101/1的引物1 1和1 2各1 yL，2mmol/ L 的 dNTP 5 μ L, 10 XExTaq Buffer 5 μ L，5 U/ μ L 的 ExTaq DNA 聚合酶 0.5 μ L,模板 1 μ L，加雙蒸水補(bǔ)齊50 μ L ;PCR擴(kuò)增條件95°C預(yù)變性5 min ;94°C變性30 s、55°C退火60 s、72°C延伸60 s，共30個(gè)循環(huán)最后72°C延伸10 min。通過瓊脂糖凝膠電泳分析純化反應(yīng)產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶，用PCR片段回收試劑盒回收出1.01Λ的目標(biāo)片段；純化好的目標(biāo)片段經(jīng)I和歷^d III雙酶切，用 PCR片段回收試劑盒回收；p^(212-h/7MX經(jīng)過I和歷/ d III雙酶切，用PCR片段回收試劑盒回收；用T4連接酶連接兩酶切純化好的片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后涂布含30 μ g/mL卡那霉素的LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)過夜；隨機(jī)挑選6個(gè)菌落， 接種于30mL含30 μ g/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，通過及I和 HinA III雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽(yáng)性克隆，陽(yáng)性重組子保存在含有15%甘油的LB培養(yǎng)基中，冷凍保存于_70°C ；重組質(zhì)粒命名為兒陽(yáng)性重組子命名為JM109/兒重組耐酸酵母命名為C42 ； (3)重組耐酸酵母C42的構(gòu)建取一支冷凍保存的JM109/pYX212-h/ MX-A/A兒接種于30 mL含30 μ g/mL卡那霉素的 LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化野生型耐酸酵母C magnoliae,堵化子涂布于含800 μ g/本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
１．一株能夠在以乳酸調(diào)節(jié)ｐＨ到２．５的培養(yǎng)環(huán)境中生長(zhǎng)但不利用乳酸的菌株，命名為木蘭假絲酵母Ｃ４（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ Ｃ４），已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０１０３６２。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：石貴陽(yáng)，張梁，丁重陽(yáng)，顧正華，王正祥，張勤，李由然，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：江南大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：32
還沒有人留言評(píng)論。發(fā)表了對(duì)其他瀏覽者有用的留言會(huì)獲得科技券。