本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種南美白對蝦中副溶血性弧菌分子預(yù)測模型的構(gòu)建方法；所述構(gòu)建方法包括如下步驟：生鮮南美白對蝦的采樣和貯藏；生鮮南美白對蝦的處理；生鮮南美白對蝦中副溶血性弧菌的活菌定量測定；根據(jù)副溶血性弧菌的活菌定量測定值構(gòu)建一級模型和二級模型；對所述一級模型和二級模型進(jìn)行驗證。本發(fā)明專利技術(shù)還提供了一種如前述的南美白對蝦中自然存在的副溶血性弧菌分子預(yù)測微生物模型的構(gòu)建方法，該構(gòu)建方法基于分子生物學(xué)技術(shù)，可用于生鮮南美白對蝦中自然存在的副溶血性弧菌行為變化的預(yù)測。本發(fā)明專利技術(shù)填補了蝦中副溶血性弧菌的預(yù)測微生物模型的空白，可為副溶血性弧菌行為變化的研究及副溶血性弧菌定量微生物風(fēng)險評估提供有效的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)設(shè)及一種生鮮南美白對郵中副溶血性弧菌分子預(yù)測模型的構(gòu)建方法及應(yīng) 用，屬于食品微生物學(xué)
技術(shù)介紹
副溶血性弧菌是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，廣泛分別于河口和海洋環(huán)境中，食用被 該菌污染的水產(chǎn)品，極易導(dǎo)致嚴(yán)重的急性腸胃炎，并伴隨有惡屯、、頭疼、低燒等癥狀，該菌引 起的食物中毒在中國已高居微生物性食物中毒的首位。南美白對郵是中國乃至于亞洲地區(qū) 最為重要的水產(chǎn)品，同時，因為其味道鮮美、營養(yǎng)豐富，也是運些區(qū)域的最受歡迎的食品之 一。然而研究報道郵類在養(yǎng)殖過程中易受副溶血性弧菌的污染，在溫暖季節(jié)該菌的自然污 染率可高達(dá)100%，對水產(chǎn)品品質(zhì)和公共衛(wèi)生造成了極大的安全隱患。 預(yù)測食品微生物模型（Predictivefoodmicrobiology)被視為解決食源性致病 菌潛在危害的重要措施之一，通過構(gòu)建食品中食源性致病菌的預(yù)測微生物學(xué)模型，可快速 地對食品中致病菌的生長情況進(jìn)行判斷，從而有效地控制食品中病原微生物的風(fēng)險。描述 不同溫度下郵中副溶血性弧菌預(yù)測微生物學(xué)模型的已有報道：Boonyawantang等研究了不 同溫度下菌株BCC24339在郵中行為變化，Tang等研究了副溶血性弧菌03:Κ6在即食郵中 的生長動力學(xué)特征，王敬敬、馬馮莉等研究了 4~3(TC條件下混合菌株在南美白對郵中的 行為變化。然而運些研究均局限于人工接種樣品中副溶血性弧菌行為變化的研究，沒有研 究真實地反應(yīng)自然存在于郵中的副溶血性弧菌的生長動力學(xué)特征。 構(gòu)建生郵中自然存在副溶血性弧菌的預(yù)測微生物模型的最大難點在于，基于選擇 性培養(yǎng)基的傳統(tǒng)平板計數(shù)方法無法完全排除復(fù)雜背景菌群的干擾，從而造成副溶血性弧菌 定量效果的失準(zhǔn)。近年來，一些研究報道，實時巧光PCR方法可W用于預(yù)測微生物學(xué)模型 的構(gòu)建，并描述食品中致病微生物的行為變化。實時巧光PCR方法的引物和探針具有極高 的特異性，可W在復(fù)雜的食品環(huán)境中做到精準(zhǔn)的定量。然而該方法也有一個巨大的缺陷： 基于DNA的實時巧光PCR方法無法區(qū)分樣品中的活菌與死菌，基于DNA的檢測方法無法區(qū) 分樣品中的死菌和活菌，從而過高估計了樣品中致病菌的數(shù)量。疊氮漠化丙錠（Propidium monoazide，PM)是一種對核酸具有高度親和力的光敏反應(yīng)染料，能夠進(jìn)入細(xì)菌的死細(xì)胞 中，選擇性地交聯(lián)死菌的DNA，將其與DNA擴(kuò)增檢測技術(shù)相結(jié)合，可有效地抑制死菌細(xì)胞DNA 的擴(kuò)增。近年來，利用PMA結(jié)合實時巧光PCR技術(shù)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種食源性致病菌的活 菌檢測，但尚未有研究利用該技術(shù)構(gòu)建預(yù)測微生物學(xué)模型。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一種南美白對郵中副溶血性弧菌分子預(yù)測模型的構(gòu)建方 法，W解決現(xiàn)有技術(shù)中所存在的上述問題。 為了實現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)的技術(shù)方案如下： 第一方面，本專利技術(shù)提供了一種南美白對郵中自然存在的副溶血性弧菌的分子預(yù)測 模型的構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法包括如下步驟：[000引生鮮南美白對郵的采樣和膽藏； 生鮮南美白對郵的處理； 生鮮南美白對郵中副溶血性弧菌的活菌定量測定； 根據(jù)副溶血性弧菌的活菌定量測定值構(gòu)建一級模型和二級模型； 對所述一級模型和二級模型進(jìn)行驗證。 作為優(yōu)選方案，所述生鮮南美白對郵的采收和膽藏的方法為： 在每年8月份對郵塘中的南美白對郵進(jìn)行一次采樣，共取540只南美白對郵樣品， 分為6組，分別置于4°C、7°C、15°C、20°C、25°C、30°C下膽藏，另取18個樣品留作副溶血性弧 菌最初污染量的定量分析備用。 作為優(yōu)選方案，樣品從采樣到膽藏的時間不超過比。 作為優(yōu)選方案，所述生鮮南美白對郵的處理的方法包括如下操作： 對不同膽藏溫度的南美白對郵進(jìn)行取樣：4°C條件下膽藏36化，每24h取6只南美 白對郵；7 °C條件下膽藏18化，每1化取6只南美白對郵；15 °C條件下膽藏75h，每化取6只 南美白對郵；20°C條件下膽藏60h，每化取6只南美白對郵；25°C條件下膽藏42h，每化取 6只南美白對郵；30°C條件下膽藏2地，每化取6只南美白對郵； 將上述南美白對郵樣品置于含有蛋白腺水溶液的均質(zhì)袋中均質(zhì)2min后，收集南 美白對郵液均漿，用于后續(xù)的副溶血性弧菌活菌定量分析。 作為優(yōu)選方案，所述副溶血性弧菌的活菌定量測定的方法包括如下操作：S1、PMA母液的制備：每980 W L (1地2〇中溶解入Im邑PMA，得到的2mM的PMA母液， 于-20°C下避光保存'[002。 S2、PMA前處理：取25μL的PMA溶液加入到975μL南美白對郵液均漿中，獲得 25μΜΡΜΑ終濃度的ΡΜΑ-樣品混合液；將所述ΡΜΑ-樣品混合液置于黑暗條件下處理15min后，利用光解儀處理后，進(jìn)行離屯、，收集菌體； S3、DNA提取：參照天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的說明書對所述菌體中的DNA 進(jìn)行提取，同時對所述說明書中的方法進(jìn)行了修正，延長了菌體的收集時間至lOmin、溶菌 酶的處理時間為比、蛋白酶K的處理時間為化；[002引 S4、PMA實時巧光PCR活菌定量測定： 選擇副溶血性弧菌的t化基因作為PMA實時巧光PCR擴(kuò)增的祀基因，W對應(yīng)的 化qMan探針標(biāo)記FAM作為報告基團(tuán)，B冊1作為澤滅基團(tuán)，所述擴(kuò)增所用的引物的序列為， 正向引物：5'-ACTCAACACAAGAAGAGATCGACAA-3 ;反向引物：5'-GATGAGCGGTTGATGTCCAA-3'， TaqMan探針的序列為：5' -FAM-CGCTCGCGTTCACGAAACCGT-B冊1-3'；[002引制備PMA實時巧光PCR反應(yīng)體系20化，其中，各組分分別為aOXPCR Buffer 2 μ L、濃度為50mM的MgS04溶液1. 2 μ L、濃度為lOmM的dNTPs mix溶液0. 5 μ L、濃度為抓/ μ L的化q DM聚合酶0. 2 μ^稀釋至終濃度為10 μ Μ的Ξ對引物各0. 5 μ L稀釋至終濃度 為10 μ Μ的Ξ根探針各0. 2 μ L、DNA模板1 μ L W及d地2012. 5 μ L ; 進(jìn)行40個循環(huán)的PM實時巧光PCR反應(yīng)，在每個所述循環(huán)中，控制95 °C預(yù)變性 2min，95°C變性時間為15s，退火溫度為60°C，退火時間為Imin; 將PMA實時巧光PCR反應(yīng)輸出的CT值與所述南美白對郵的副溶血性弧菌濃度與 CT值關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對照，獲得對應(yīng)的南美白對郵中的副溶血性弧菌濃度。[002引標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建：稱取8份生鮮南美白對郵25g分別放入8只無菌均質(zhì)袋中，在每 只所述無菌均質(zhì)袋中加入225mL的蛋白腺水均質(zhì)2min，獲得8份10倍稀釋的南美白對郵 液勻漿，在每份南美白對郵液勻漿中加入不同稀釋梯度的副溶血性弧菌ATCC33847菌液， W獲得攜帶菌量為102到10SCRJ/g的南美白對郵液勻漿，W獲得南美白對郵體內(nèi)的副溶血 性弧菌的濃度對PMA實時巧光PCR輸出結(jié)果的關(guān)系曲線。采用上述的PMA實時巧光PCR體 系反應(yīng)，利用菌落計數(shù)的結(jié)果和PM實時巧光PCR輸出的CT值構(gòu)建反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計 算曲線的斜率（slope),利用公式E= 計算多重實時巧光PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率。 其結(jié)果表明，該PM實時巧光PCR體系具有良好的擴(kuò)增當(dāng)前第1頁1 2&nbs本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
一種南美白對蝦中副溶血性弧菌的分子預(yù)測模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法包括如下步驟：生鮮南美白對蝦的采樣和貯藏；生鮮南美白對蝦的處理；生鮮南美白對蝦中副溶血性弧菌的活菌定量測定；根據(jù)副溶血性弧菌的活菌定量測定值構(gòu)建一級模型和二級模型；對所述一級模型和二級模型進(jìn)行驗證。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：趙勇，張昭寰，婁陽，肖莉莉，王旭，潘迎捷，
申請(專利權(quán))人：上海海洋大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：上海;31
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