本發明專利技術涉及一種核酸內切酶MUS81檢測試劑盒及其檢測方法和應用，包括如下試劑：酶切底物、裂解液以及酶切液。檢測方法包括：通過電泳法或細菌克隆形成法測定核酸內切酶MUS81的活性。本發明專利技術檢測惡性腫瘤患者外周血中核酸內切酶MUS81的活性，滿足臨床診斷、治療監測及預后判斷的需求；充分考慮腫瘤患者外周血中MUS81活性改變的特殊性，故針對性強，有較好的臨床應用前景。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于惡性腫瘤檢測領域，特別設及一種核酸內切酶MUS81檢測試劑盒及其 檢測方法和應用。
技術介紹
近年，由于環境及生活方式的改變，我國惡性腫瘤的發病率顯著升高，其中特別是 肺癌、腸癌、卵巢癌等。研究證實，基因組不穩定性對腫瘤的發生發展具有重要作用；核酸內 切酶是在維持基因組完整性中起關鍵作用的酶，因而其活性的變化與腫瘤的發生、發展密 切有關。 通常將能降解DNA分子的酶，稱為核酶，其中分又為兩種：能從多核巧酸鏈的末端 開始水解核酸的酶稱為核酸外切酶；而從多核巧酸鏈中間開始水解核酸的酶稱為核酸內切 酶（endonuclease,EN)。在核酸水解酶中，EN為水解分子鏈內部憐酸二醋鍵生成寡核巧酸 的酶。值得一提的是，人們在研究特異性的限制-修飾現象時，發現了核酸內切酶，該酶可 抵御外源物入侵。一個細胞具有多種不同功能的、有較好活性的核酸內切酶將會保護細胞 不被破環。核酸內切酶是一類廣泛存在于細胞內的核酸水解酶，在體內參與宿主防御機制、 腫瘤細胞的形成與發展等有關。 MUS81(methylmethanesulfonate,UVsensitive,geneclone81,對MMS及UV 敏感的81號基因）基因是Int&rthal等利用酵母雙雜交技術發現Mol GenGenet，2000,263(5):812-827];其在DM損傷修復W及染色體穩定性維持起作用。敲 除Mus別基因的酵母菌較正常酵母菌對甲橫酸鹽（MM巧和紫外線0JV)更敏感，故命名為 MUS81。人MUS81，為XPF-ERCC1家族的核酸內切酶，與EME1/EME2(無催化活性、參與維 持復合物的穩定性）相結合形成一種DNA結構特異的限制性內切酶，可W結合DNA、參與 DNA損傷修復及基因組不穩定的調控eMUSSl可修復DNA正常代謝過 程中產生的斷裂雙鏈W及暴露于某種化學試劑和放射線產生的斷裂雙鏈，是皿修復的關 鍵組分。MUS81可影響基因組不穩定和皿過程，在體細胞中MUS81突變、缺失或減少增加了 基因組不穩定性。最近研究掲示，MUS81可與其他分子相互作用，例如在DNA損傷的位點，與 RMI/FANCM形成復合物，共同發揮修復作用。MUS81復合物也可與DNA修復分子如RAD52/ RAD54等結合，運些中間產物可顯著促進核酸內切酶活性。MUS81在S期及Μ期均參與細胞 周期的調控，從而保證基因組的完整性和穩定性。 研究發現，MUS81與皿異常密切相關，MUS81表達水平下調后，皿活性顯著下降。 由于人正常細胞內端粒酶活性被抑制，端粒會隨著細胞分裂增加而逐漸縮短，當端粒縮短 到臨界長度時，此時的端粒結構易被識別為DNA損傷，從而激活DNA損傷應激通路，細胞衰 老或調亡。Zeng等發現，MUS81可被招募到端粒延長替代機制（Alternativelengthening oftelomere,ALT)細胞的核屯、結構，作用于ALT細胞端粒重組的D-loop結構，從而促進ALT 細胞端粒的同源重組。端粒重復結合因子2(TRF2)可結合于MUS81，從而抑制其核酸內切酶 活性。而且，HR修復核屯、酶MUS81在惡性腫瘤發生、進展中表達異常，會增加HR活性和持 續影響基因表達譜。 對于核酸內切酶活性測定，通過酶切消化DNA，來分析樣本中的酶活性，然后電泳 染色呈現大小不一的片段，對運些片段的遷移率及數量進行分析。核酸內切酶的酶切效率 與底物的性質有很大的關系，底物的單雙鏈結構、分子構型、DNA鏈中酶識別位點的數目W 及位點附近的序列等都影響著酶的催化反應。共價閉合環（超螺旋構型）DNA比其相應的 線性分子的酶解作用要慢，要使超螺旋構型DNA徹底降解，需要的酶量相對就大。對于DNA 雙鏈的酶切，反應液中鹽的濃度至關重要，要確定合適的鹽濃度，核酸內切酶對儀離子等的 要求并不嚴格，5-30mmol/L均可作用。酶切效果主要與酶的活性密切相關，與反應時間也相 關，時間一般不宜超過1.化，酶切的溫度一般控制在37°C。酶切反應可用熱（65°C)lOmin、 過量邸ΤΑ或用酪提取來終止。 惡性腫瘤易復發、轉移，進展快，預后差。核酸內切酶如MUS81在DNA損傷后參與 修復途徑（HR途徑），如果其表達異常，會引起腫瘤基因組不穩定加劇、基因重排增加。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是提供一種核酸內切酶MUS81檢測試劑盒及其檢測 方法和應用，該試劑盒檢測惡性腫瘤患者外周血中核酸內切酶MUS81的活性，滿足臨床診 斷、治療監測及預后判斷的需求；充分考慮腫瘤患者外周血中MUS81活性改變的特殊性，故 針對性強，有較好的臨床應用前景。 本專利技術的一種核酸內切酶MUS81檢測試劑盒，包括如下試劑：酶切底物、裂解液W 及酶切液。 所述酶切底物為質粒DNA，序列如SEQ ID NO. 1所示。 所述裂解液的組成為：〇.Olmol/L憐酸鹽溶液PBS、4-6%CHAI^和0. 1-0. 2U/μ1 RNaseinhibitor;其中，憐酸鹽溶液的抑值為7. 4。 所述酶切液的組成為：0.Olmol/L憐酸鹽溶液PBS、4-6%CHAPS、0. 1-0. 2υ/μ1 RNaseinhibitor、l-2mmol/LMgClz和 0.1-0. 2mmol/LDTT;其中，憐酸鹽溶液的抑值為 7. 4。 本專利技術的一種核酸內切酶MUS81檢測試劑盒的檢測方法，包括如下步驟： (1)將收集到的惡性腫瘤細胞加入裂解液，裂解細胞60~90min;然后反復吸取混 勻，離屯、吸取上清，-90°C~-70°C凍存；根據裂解的細胞數或者直接測定總蛋白濃度，配制 成混合液； (2)向混合液中加入溶解于酶切液的質粒DNA，在振蕩器上溫和振蕩，然后離屯、數 秒，37~38°C恒溫水浴中解育30~40min，隨后80~90°C水浴作用10~20分鐘或用邸TA 終止反應； (3)最后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據酶切底物被切割的程度判斷核酸內切酶 MUS81的活性或者進行轉化細菌，根據菌落形成能力的強弱判斷核酸內切酶MUS81的活性。 所述步驟（3)中的瓊脂糖凝膠電泳檢測的條件為：20ul混合溶液；1%的瓊脂糖凝 膠；電泳時間Ih;穩定電壓130V。 本專利技術的一種核酸內切酶MUS81檢測試劑盒的應用，應用于檢測惡性淋己瘤、肺 癌、胃腸道腫瘤、乳腺癌或卵巢癌單個核細胞的核酸內切酶MUS81活性升高。 核酸內切酶MUS81有W下幾種基本功能： (1)在腫瘤發生或進展時，該酶的活性可顯著升高； (2)惡性腫瘤患者外周血液中該蛋白其可W與惡性腫瘤患者輔助診斷及預后判斷 中發生淋己結或遠處轉移的機體狀態密切相關，該酶的活性異常升高； 陽0巧 （3)核酸內切酶活性主要設及MUS81的核酸酶。 本專利技術的特點在于：(A)特異性強，專一反映核酸內切酶的活性；度）結果觀察直 觀，條帶切割后或菌落生長易于計算及比較分析。 有益效果本專利技術檢測惡性腫瘤患者外周血中核酸內切酶MUS81的活性，滿足臨床診斷、治 療監測及預后判斷的需求；充分考慮腫瘤患者外周血中MUS81活性改變的特殊性，故針對 性強，有較好的臨床應用前景。【附圖說明】 圖1為環狀雙螺旋質粒DNA經切割后的條帶；其中，A為本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種核酸內切酶MUS81檢測試劑盒，其特征在于：包括如下試劑：酶切底物、裂解液以及酶切液。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：盧仁泉，郭林，高翔，
申請(專利權)人：復旦大學附屬腫瘤醫院，
類型：發明
國別省市：上海;31
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