同時檢測引起蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的實時熒光PCR引物探針組合及方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供一種用于同時檢測引起蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的實時熒光PCR引物探針組合，所述引物探針組合的序列分別如SEQ?ID?No.1-6所示。本發(fā)明專利技術(shù)還基于所述引物探針組合建立了同時檢測引起蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的實時熒光PCR方法，可實現(xiàn)對引起蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的檢測。本發(fā)明專利技術(shù)的實時熒光PCR引物探針組合及檢測方法特異性好、通量高、快速，提高了檢測效率，為引起蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的檢測提供了更有效的方法。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)設(shè)及分子生物學檢測技術(shù)，具體地說，設(shè)及一種同時檢測引起蘋果牛眼果 腐病的4種病原菌的實時巧光PCR引物探針組合及方法。
技術(shù)介紹
蘋果牛眼果腐病度uirs-eyerotofapple)是我國關(guān)注的進境水果真菌病害， 病原菌包括Neofabraeamalicorticis、N.perennans、N.a化a和N.kienholzii運 4 個種， 其中N.malicodicis(異名：Peziculamalicodicis)被列入我國進境植物檢疫性有害生 物名錄中。蘋果牛眼果腐病是蘋果和梨重要的采后病害，難W防控，不僅為害果實，導致嚴 重的采后損失，而且可侵害枝條、樹干，導致樹勢衰弱、幼樹死亡。其在世界范圍內(nèi)廣泛分 布，但尚未在我國發(fā)現(xiàn)。該病一旦傳入我國，在我國蘋果產(chǎn)區(qū)擴散、定殖的可能性很大，將對 我國蘋果生產(chǎn)造成嚴重威脅，十分必要加大口岸檢疫力度，嚴防該病菌的傳入。然而，蘋果 牛眼果腐病菌相似的形態(tài)特征和生理特性使運些病原菌的區(qū)分非常困難，要求鑒定者必須 具備豐富的真菌分類學基礎(chǔ)與經(jīng)驗。加之傳統(tǒng)檢驗方法周期長，不符合進境水果快速通關(guān) 的要求，使其成為進境水果真菌病害檢疫的瓶頸。因此建立快速準確的檢測體系尤為必要。 近年隨著分子生物學技術(shù)的迅速發(fā)展，大量WPCR為基礎(chǔ)的技術(shù)廣泛地運用到植 物病原菌的鑒定中，大大提高了鑒定的速度和準確性。實時巧光PCR結(jié)合了巧光檢測系統(tǒng) 和PCR擴增系統(tǒng)，通過巧光放大檢測信號，在PCR擴增的過程中就能檢測模板DNA的擴增， 不需要凝膠電泳分析，簡化了檢測程序，與常規(guī)的PCR比較更能縮短檢測周期。而且其檢測 特異性強，靈敏度高，其運用范圍越來越廣泛。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是針對W上要解決的技術(shù)問題，提供一種特異性好、靈敏度高的同 時檢測引起蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的實時巧光PCR引物探針組合。 本專利技術(shù)的另一個目的是提供一種用于實時巧光PCR檢測引起蘋果牛眼果腐病的4 種病原菌的試劑盒。 本專利技術(shù)的再一個目的是提供同時檢測引起蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的實時 巧光PCR方法。 為了實現(xiàn)本專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)提供了一種同時檢測引起蘋果牛眼果腐病的4種病 原菌的實時巧光PCR引物探針組合，該引物探針組合包括W下引物： NeoF:5' -CCCTCGGTGGGGCAAAG-3'; NeoR:5' -CCAACTCGGCGGCTTCC-3f; MAL-P：FAM-TCATCATCATTTTCATCATC-MGB； 陽R-P:CY5-CGCGTATCGCAACATCATCATTTTCATCAT-B冊2 ; ALB-P:肥D-AAGATGTTCAACCCCTCCCTCGCGTA-B冊 1 ; KIE-P :肥X-TGACCACTTGATGATCTC-MGB ; 其中，F(xiàn)AM、CY5、肥D、肥X為巧光基團，MGB、B冊1、B冊2為巧滅基團。 上述引物中，Neo F和化0R為檢測蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的通用引物； MAkPa為檢測N. malico;rticis的特異性探針；PER-Pb為檢測N. perennans的特異性探針； ALB-Pc為檢測N. a化a的特異性探針；KIE-Pd為檢測N. kienholzii的特異性探針。 本專利技術(shù)還提供了用于實時巧光PCR檢測引起蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的試劑 盒，該試劑盒含有上述引物探針組合。 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2\PCR反應緩沖液中的至少 一種。 更優(yōu)選地，所述試劑盒還包括陽性對照。 本專利技術(shù)進一步提供了一種同時檢測引起蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的實時巧 光PCR方法，即利用所述引物探針組合進行實時巧光PCR檢測待測樣品。 具體地，所述方法包括W下步驟：1)提取待檢測樣品中的DNA;2)W步驟1)中提 取的DNA為模板，進行實時巧光PCR擴增反應；3)分析Ct值。[002。 其中，實時巧光PCR反應體系W20μL計為：[002引模板DNA 50ng， 引物 每條引物的終濃度均為〇.5μπιο1/1， 探針 每條探針的終濃度均為0. 25 μ mol/l，2XThunderbird Probe qPCR Mix 10 μL, (1地2〇補足至20 μ L ;其中，2XThunderbirdProbeqPCRMix內(nèi)含DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應緩沖 液、ROX。2X化underbirdProbeqPCRMix購自東洋紡（上海）生物科技有限公司，貨號 為WS-101。 其中，實時巧光PCR反應條件為：95°C10分鐘；94°C15秒，60°C60秒，共40個循 環(huán)，每個循環(huán)結(jié)束后在FAM、CY5、肥D、肥X通道下檢測巧光信號。 上述方法中，步驟3)中根據(jù)FAM、CY5、肥D、肥X通道下的巧光信號Ct值進行結(jié)果 判斷。若FAM通道下Ct值小于35,貝Ij判為N.malicodicis陽性，若Ct值大于35或無擴增 信號則判為N.malico;rticis陰性；若CY5通道下Ct值小于35,卯J判為N.perennans陽性， 若Ct值大于35或無擴增信號則判為N.perennans陰性；若肥D通道下Ct值小于35,卯J判 為N.a化a陽性，若Ct值大于35或無擴增信號則判為N.a化a陰性；若肥X通道下Ct值小 于35,卯J判為N.kienholzii陽性，若Ct值大于35或無擴增信號則判為N.kienholzii陰 性； 本專利技術(shù)根據(jù)4種蘋果牛眼果腐病菌的EF-la基因特異序列，設(shè)計了 1對通用引物 和4條特異性探針，并基于運些引物探針組合建立了同時檢測引起蘋果牛眼果腐病的4種 病原菌的實時巧光PCR方法，可實現(xiàn)對樣品的定性檢測。 實驗表明，本專利技術(shù)的引物探針組合、試劑盒及檢測方法特異性好、靈敏度高、通量 高、快速，提高了檢測效率，為引起蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的檢測提供了更有效的方 法。【附圖說明】圖1為本專利技術(shù)在FAM通道下的特異性實驗結(jié)果，其中從左至右1-2分別為菌株CBS 102863、CBS102872。圖2為本專利技術(shù)在CY5通道下的特異性實驗結(jié)果，其中從左至右1-6分別為菌株CBS 139. 4UCBS102869、CBS102873、CBS453. 64、VPRI41734、VPRI10502。圖3為本專利技術(shù)在肥D通道下的特異性實驗結(jié)果，其中從左至右1-6分別為菌株CBS 109875、CBS102871、CBS628. 72、CBS452. 64、CBS304. 62、CBS261.32。 圖4為本專利技術(shù)在肥X通道下的特異性實驗結(jié)果，其中1為菌株CBS355. 72。 圖5為本專利技術(shù)在FAM通道下的靈敏度實驗結(jié)果，其中1-6分別為濃度10化g/μ^ lOng/μLIng/μLO.Ing/μLO.Olng/μL和 0.OOlng/μL。 圖6為本專利技術(shù)在CY5通道下的靈敏度實驗結(jié)果，其中1-5分別為濃度l(K)ng/μL lOng/μL Ing/μLO. Ing/μL和 0.Olng/μL。 圖7為本專利技術(shù)在肥D通道下的靈敏度實驗結(jié)果，其中1-6分別為濃度10化g/μL lOng/μLIng/μLO.Ing/μLO.Olng/μL和 0.OOlng/μL。本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種同時檢測引起蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的實時熒光PCR引物探針組合，該引物探針組合包括以下引物：Neo?F：5′?CCCTCGGTGGGGCAAAG?3′；Neo?R：5′?CCAACTCGGCGGCTTCC?3′；MAL?P：FAM?TCATCATCATTTTCATCATC?MGB；PER?P：CY5?CGCGTATCGCAACATCATCATTTTCATCAT?BHQ2；ALB?P：NED?AAGATGTTCAACCCCTCCCTCGCGTA?BHQ1；KIE?P：HEX?TGACCACTTGATGATCTC?MGB；其中，F(xiàn)AM、CY5、NED、HEX為熒光基團，MGB、BHQ1、BHQ2為猝滅基團。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王衛(wèi)芳，林惠嬌，胡學難，何日榮，
申請(專利權(quán))人：廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，中華人民共和國黃埔出入境檢驗檢疫局，
類型：發(fā)明
國別省市：廣東;44