普通小麥抗病序列的全基因組SSR特異分子標記及開發方法技術

本發明專利技術涉及植物分子標記引物設計方法，具體為基于普通小麥抗病序列的全基因組SSR特異分子標記開發方法，解決目前現有的小麥抗病育種SSR標記存在點位多、與目的基因距離較遠的問題，操作步驟為：1）、下載全基因組數據，建立本地數據庫；2）、用抗病類基因家族的隱馬爾可夫模型檢測數據庫，所得序列經篩選得包含目標抗病結構的蛋白序列，再檢索本地數據庫，得到相應的基因組序列片段scaffold；3）、檢測每條scaffold序列中的簡單重復序列位點，在SSR位點兩側設計引物，合成；4）、特異標記篩選；5）、標記多態性檢測。SSR特異分子標記的核苷酸序列為：SEQ?ID?NO.1至SEQ?ID?NO.78所示的序列。優點：1、位置明確、特異性強；2、與抗病候選基因距離極其緊密。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術設及植物分子標記引物設計方法，尤其設及小麥分子標記引物設計方法， 具體為普通小麥抗病序列的全基因組SSR特異分子標記及開發方法。
技術介紹
小麥作為我國傳統的主糧作物，其生產關乎國家糧食安全和人民生活水平，然而 由病原菌入侵引起的白粉病、誘病等小麥病害在我國各大麥區均常年發生，導致小麥嚴重 減產。W白粉病為例，1990年和1991年全國白粉病大爆發造成當年1.44億噸和0.77億 噸小麥產量的損失。小麥抗病分子育種可大大縮短育種年限，使育成種能盡快用于生產 減少損失，是防治小麥病害最經濟、安全和有效的方法。育種過程中用于抗病基因定位和 輔助選擇的分子標記主要是SSR(SimpleSequenceRepeats)標記，該類標記為第二代 分子標記，變異豐富而且成本低廉。在小麥測序草圖未公布之前，有專利技術（申請號 201310579379. 1)利用現有SSR標記引物比對小麥片段重疊群來擴充標記數量，從而加密 遺傳圖譜。但由于小麥具有龐大的基因組(為水稻的40倍，玉米的6. 6倍)和高度重復的序 列（80%W上)，使得利用序列片段開發的SSR標記常存在多位點現象，加之用于分子標記輔 助選擇（MAS,MarkerAssistedSelection)的SSR標記與目標基因遺傳距離大都在IcMW 上，極容易造成MAS過程中標記所跟蹤信息的丟失，導致育種失敗。該專利方法雖然增加了 SSR標記的多態性，但由于其自身方法存在的局限性，仍無法解決SSR標記本身存在的位點 多W及與目的基因距離遠的問題。而目前雖然研發出了高精準度的商業化SNP標記忍片， 卻因成本較高，不能大規模用于實際生產。 植物中的抗病基因能通過編碼不同的保守蛋白結構來抵御病原菌入侵，如蛋白激 酶（proteinkinase,PK)、跨膜結構域（transmembranedomain,TM)和核巧酸結合位點 (nucleotidebindingsite,NBS)等，其中NBS類基因是植物中數量最多的一類抗病基 因。在目前已克隆的13個小麥抗病基因中，/?泌、你光、巧??·?/、/?必·、化Zr7、化 義5>甘5運10個基因均為NBS類抗病基因，其余3個為ΡΚ類（/?。厶ZrJ仿和TM類（/?泌） 抗病基因。隨著2014年小麥測序草圖的公布，使得在全基因組范圍內分離小麥抗病序列成 為可能?；谛←溈共⌒蛄虚_發的SSR標記，不但保留了豐富多態性，而且具有極高的特異 性W及與抗性的連鎖程度，并且成本低廉，可廣泛用于小麥抗性基因定位、候選基因篩選、 遺傳圖譜構建W及分子標記輔助育種等。
技術實現思路
本專利技術解決目前現有的小麥抗病育種SSR標記存在點位多、與目的基因距離較遠 的問題，提供一種普通小麥抗病序列的全基因組SSR特異分子標記及開發方法。 陽0化]本專利技術是采用如下技術方案實現的：普通小麥抗病序列的全基因組SSR特異分子 標記開發方法，包括W下操作步驟： 1) 、本地數據庫構建：下載普通小麥品種蛋白數據和全基因組數據，建立本地數據庫； 2) 、目的序列獲得及檢測：利用已克隆抗病類家族基因得到的隱馬爾可夫模型文件檢 索小麥蛋白數據，所得序列經結構域檢測篩選出包含目標抗病結構的完整編碼蛋白序列， 根據小麥蛋白序列的染色體分布圖選出位于某一染色體上的序列，將運些序列檢索本地全 基因組數據庫得到相應的基因組序列片段（即scafTold); 3) 、SSR位點確定及標記開發：檢測每條scafTold序列上的簡單重復序列位點，在SSR 位點兩側設計引物，合成核巧酸序列，得到相應的SSR分子標記。 第一步利用小麥蛋白數據和全基因組數據建立本地數據庫，便于后續進行數據檢 索。第二步利用現有技術中可下載得到的已克隆抗病類基因家族的模型文件檢索本地蛋白 數據庫，獲得包含完整目標結構的蛋白序列；為方便下一步染色體特異標記的開發，W單條 染色體臂為單位，將每條臂上所有目標蛋白序列檢索基因數據庫，得到對應的基因組序列 片段，完成目標蛋白序列向基因序列的轉化。第Ξ步將得到的基因序列檢索得到SSR位點， 在位點兩側設計引物，送至公司合成相應的核巧酸序列，即得到本專利技術方法開發的SSR分 子標記。 本專利技術還可W包括W下操作步驟：4)、特異標記篩選缺體-四體和雙端體材料 的基因組DNA作為模板，所合成SSR標記為引物進行PCR反應，所述PCR反應的產物經8% 非變性聚丙締酷胺凝膠電泳后用銀染法染色，于燈箱上觀察并拍照記錄。拍照結果顯示，標 記在某個缺體-四體中擴增不出目標帶，表明該標記位于此缺體-四體所缺失的染色體上， 標記在雙端體中擴增不出目標帶，表明該標記不在此雙端體染色體臂上，而是位于其對應 的另外一半染色體臂上。[000引本專利技術在保留了現有SSR標記技術變異類型豐富和成本低廉的基礎上，還具有W下有益效果：1、位置明確、特異性強；本方法中開發的每個分子標記均具有明確的基因組 位置，并且經過中國春缺體-四體和雙端體材料篩選，標記具有極高的特異性，大大減少了 基因定位過程中小麥A、B、D亞基因組之間的誤差；2、與抗病候選基因距離極其緊密；本方 法中開發的每個分子標記均與小麥抗病序列位于同一條scafTold序列上，當某個抗病序 列被確定為抗病基因時，其最近的SSR標記與之緊密連鎖，幾乎不發生交換，可W作為共分 離標記使用，極大的提高了育種過程中分子標記輔助選擇的效率。【附圖說明】 圖1為小麥2AL染色體上NBS-SSR標記開發流程圖； 圖2為小麥TaNBS蛋白序列的染色體分布； 圖3為小麥NBS-SSR標記的特異性篩選圖； 圖4為小麥NBS-SSR特異標記多態性檢測圖。【具體實施方式】 為了使本專利技術的技術方案更加清楚明白，接下來W普通小麥品種中國春2A染色 體長臂上NBS-SSR標記開發為例，結合附圖對本專利技術進行進一步詳細說明。 基于小麥NBS抗病序列的全基因組SSR特異分子標記開發方法： 1)、本地數據庫構建：從URGI數據庫 〇ittps://urgi·Versailles,inra.fr/)中 下載普通小麥品種中國春蛋白數據（Ta.IWGSC2.25.p巧.all.fa)和全基因組數據（Ta.IWGSC2. 25.化a.c虹ο. 2AL.fa),利用NCBI本地BLAST工具建立本地全基因組數據庫，所用 命令為i^ormatdb-iTa.IWGSC2. 25.化a.C虹0. 2AL.fa-pF-〇t; 2)、目的序列獲得及檢測J:從Pfam數據庫化ttp://pfam. sanger. ac.址/)中下載 NBS家族(登錄號為PF00931)的隱馬爾可夫模型文件NB-ACR.hmm，在Hmmer3.0軟件中 通過hmmsearch程序檢索小麥蛋白數據包，獲得3982條蛋白序列，之后用SMART服務器 化t1:p://sma;rt. embl-heide化erg. de/)進行結構域檢測，E值設為0,從中篩選出2406條 包含NBS結構的完整蛋白序列，根據序列編號選出位于2AL染色體上的56條NBS序列巧曰 圖2所示，2AL染色體上包含56條NBS序列)，將運些序列檢索本地全基因組數據庫得到相 應的基因組序列片段（scaffold),檢索命令為本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種基于普通小麥抗病序列的全基因組SSR特異分子標記開發方法，其特征為包括以下操作步驟：1）、本地數據庫構建：下載普通小麥品種蛋白數據和全基因數據，建立本地數據庫；2）、目的序列獲得及檢測：利用已克隆抗病類家族基因得到的隱馬爾可夫模型文件檢索小麥蛋白數據，所得序列經結構域檢測篩選出包含目標抗病結構的完整編碼蛋白序列，根據小麥蛋白序列的染色體分布圖選出位于某一染色體上的序列，將這些序列檢索本地全基因組數據庫得到相應的基因組序列片段scaffold；3）、SSR位點確定及標記開發：檢測每條scaffold序列上的簡單重復序列位點，在SSR位點兩側設計引物，合成核苷酸序列，得到相應的SSR分子標記。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：喬麟軼，暢志堅，張曉軍，常建忠，鄭軍，李欣，詹海仙，郭慧娟，高建剛，張文萍，
申請(專利權)人：山西省農業科學院作物科學研究所，
類型：發明
國別省市：山西;14