回收植物來源的蛋白質的方法技術

提供了回收植物來源的蛋白質或超結構蛋白的方法。該方法可包括獲取包含定位于質外體之蛋白質或超結構蛋白的植物或植物物質,松動細胞壁以產生具有松動細胞壁的植物或植物物質,從而使得質外體內容物通過細胞壁釋放以由所述植物或植物物質產生質外體內容物級分,以及回收質外體內容物級分。質外體內容物級分包含植物來源的蛋白質或超結構蛋白。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及。更具體地，本專利技術提供從植物和植物組織獲取蛋白質(包括蛋白超結構(suprastructure))的方法。
技術介紹
目前宿主細胞(例如大腸桿菌、昆蟲細胞培養物和哺乳動物細胞培養物)中的重組表達策略在培養基中以非常高的水平表達和分泌蛋白質。使用這些系統獲得了高水平表達、正確蛋白質折置和蛋白質翻譯后修飾。此外，由于可以容易地將細胞內蛋白質與其他組分(DNA、囊泡、膜、色素等)分離，所表達蛋白質的純化得以簡化。對于植物或酵母表達系統，細胞壁阻止表達的蛋白質分泌到培養基中。廣泛使用不同的科學方法來產生細胞提取物。對于某些類型的蛋白質或細胞組分，通常不選擇機械方法來破壞細胞壁并釋放其內容物。將目的蛋白質直接表達入細胞培養基，使得能夠通過離心或過濾去除細胞內雜質，從而使目的蛋白質被簡單快速地富集。還可期望在將目的蛋白質或蛋白超結構用于疫苗配制之前，從存在于植物或植物物質中的一些或全部蛋白質、DNA、膜片段、囊泡、色素、碳水化合物等中分離目的蛋白質或蛋白超結構，包括蛋白花環(protein rosette)、納米顆粒、大蛋白復合物、抗體或病毒樣顆粒(virus-like particle, VLP)等等。免疫球蛋白(IgG)是對多種性質的特定抗原性對應物有特征性親和力的復雜異多聚體蛋白質。當今IgG產生細胞系的常規分離和IgG定向進化和分子改造技術的出現極大地影響了它們作為生物治療劑和在一般生命科學應用中的改進。治療性單克隆IgG(單克隆抗體，mAb)在目前的新抗炎藥和抗癌藥市場中占主導地位，并且目前正在對數百種新候選藥物進行研究和臨床開發以獲得改進的或新的應用。每年mAb的市場需求從幾克(診斷)、幾千克(抗毒素)到一百或數百千克(生物防護、抗癌、抗感染、抗炎)。W02008 /151440(通過引用并入本文)描述了從植物生產經修飾的糖蛋白的方法。PCT公開W000 / 09725 (Turpen等)描述了一種從植物細胞間間隙提取蛋白質的方法，其包括真空和離心處理以提供包含目的蛋白質的間質液(interstitial fluid)提取物。該方法適于能在真空和離心條件下通過微纖維網格的小蛋白質(50kDa或更小)，但不適于較大蛋白質、超結構蛋白(superstructure protein)、蛋白花環、納米顆粒、大蛋白復合物例如抗體或VLP。1999 年 McCormick 等(Proc Natl Acad Sci USA96:703-708)公開了使用與單鏈Fv(scFV)表位融合的大米淀粉酶信號肽將表達的蛋白質靶向到細胞外部分(compartment),隨后通過對葉和莖組織進行真空過濾來回收scFv多肽。2008年Moehnke等(Biotechnol Lett30:1259-1264)描述了使用McCormick的真空過濾法通過質外體提取從煙草中獲得重組植物過敏原。PCT公開W02003 / 025124(Zhang等)公開了在植物中表達scFv免疫球蛋白，其通過鼠信號序列靶向質外體空間。病毒樣顆粒(VLP)可用于制備疫苗，例如流感疫苗。超結構(例如VLP)模擬病毒衣殼結構，但缺少基因組，從而不能復制或提供再次感染。VLP刺激強免疫應答，為分離(可溶)的重組抗原提供了改進的替代方法。VLP在特定病毒蛋白表達后進行組裝并具有類似于其同類病毒的外表面，但不同于真的病毒顆粒，遺傳物質不會整合到其中。與天然病毒類似的顆粒狀多價結構抗原的呈遞引發具有均衡的體液和細胞成分的增強的免疫應答刺激。認為優于分離抗原產生之刺激的這種改進對于包膜病毒尤其適用，因為包膜VLP以其天然膜結合狀態呈遞表面抗原(Grgacic和Anderson, 2006年，Methods40, 60-65)。此外，已證明與重組血凝素HA(即單體HA，或組成花環的HA ;3-8個三聚體的HA組裝物)相比，擁有納米顆粒組織結構的流感VLP是更佳的候選疫苗，并且他們能激活體液和細胞免疫應答。(Bright, R.A.,等，2007，Vaccine25, 3871-3878)。之前W02009 / 009876和W02009 / 076778的專利技術人已描述了包含脂質包膜的流感HA VLP的生產(D’Aoust等；兩者均通過引用并入本文)。對于包膜病毒，病毒保留脂質層或膜可以是有利的。不同系統的脂質構成可以有所不同(例如植物生成的包膜病毒會在包膜中包含植物脂質或植物留醇)，這可有助于增強免疫應答。Mason等描述了表達HBV表面抗原(HBsAg)的轉基因煙草中包膜VLP的組裝(1992年，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89, 11745-11749)。已證明植物生成的HBV VLP在腸胃外施用時在小鼠中誘導強B和T細胞免疫應答(Huang等，2005年，Vaccine23，1851-1858)，但飼喂實驗的經口免疫僅誘導了中度的免疫應答(Smith等，2003年，Vaccine21, 4011-4021)。Greco (2007年，Vaccine25，8228-8240)證明與HBsAg融合的人免疫缺陷病毒(HIV)表位在轉基因煙草和擬南芥(Arabidopsis)中表達時累積為VLP，產生了二價VLP疫苗。在轉基因煙草和馬鈴薯植株中表達病毒衣殼蛋白(NVCP)導致無包膜VLP的組裝(Mason 等,1996 年,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA93, 5335-5340)。已在農桿菌浸潤的本塞姆氏煙草(N.benthamiana)葉中產生了 NVCP VLP(Huang 等 2009 年，BiotechnOl.Bioeng.103, 706-714),并且在小鼠中證實了其經口施用后的免疫原性(Santi等，2008年，Vaccine26，1846-1854)。給健康成人志愿者施用含有215-751 μ g VLP形式的NVCP的2或3劑量生馬鈴薯在95 %的免疫志愿者中產生免疫應答(Tacket等2000年，J.1nfect.Dis.182，302-305)。還由 HBV 核心抗原(HBcAg ；Huang 等，2009 年，Biotechnol.Bioeng.103，706-714)、人乳頭狀瘤病毒(HPV)主要衣殼蛋白LI (Varsani等，2003年，Arch.Virol.148，1771-1786)的表達獲得了無包膜 VLP。期望有更簡單的蛋白質或蛋白超結構生產系統，例如依賴于僅一種或幾種蛋白質的表達的系統。在植物系統中生產蛋白質或蛋白超結構(例如但不限于蛋白花環、納米顆粒、大蛋白復合物例如抗體或VLP)是有利的，因為植物可以培養在溫室或田間，并且不需要無菌組織培養法和處理。期望有這樣的回收蛋白質或蛋白超結構的方法，其中蛋白質或蛋白超結構基本上不含植物蛋白質或容易與其分離，但仍保留蛋白質或蛋白超結構的結構和特性。專利技術概述本專利技術涉及。更具體地，本專利技術提供從植物和植物組織中回收蛋白質(包括蛋白超結構)的方法。本專利技術的一個目的是提供回收植物來源的蛋白質的改進方法。本專利技術提供了制備植物來源之蛋白質、蛋白質或超結構蛋白的方法(A)，包括:獲取定位于質外體(apoplast)中的包含植物來源之蛋白質本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2011.03.23 US 61/466,8891.回收植物來源的蛋白質或植物來源的超結構蛋白的方法，其包括: a.獲取植物或植物物質，其包含定位于質外體的植物來源的蛋白質或定位于質外體的植物來源的超結構蛋白； b.處理所述植物或植物物質以松動細胞壁，從而產生具有松動細胞壁的植物或植物物質，由此使得釋放包含所述植物來源的蛋白質或所述植物來源的超結構蛋白的質外體級分；以及 c.回收所述包含所述植物來源的蛋白質或所述植物來源的超結構蛋白的質外體級分。2.根據權利要求1所述的方法，其中在所述處理步驟(步驟b)中包括化學處理、酶處理、生物處理、物理處理或其組合。3.根據權利要求2所述的方法，其中所述物理處理包括超聲。4.根據權利要求2所述的方法，其中所述化學處理包括用一種或多于一種螯合劑、質子供體、羥基自由基、氫氧化鉀、吲哚-3-乙酸、咪唑或其組合進行處理。5.根據權利要求2所述的方法，其中所述酶處理包括酶滲入。6.根據權利要求5所述的方法，其中所述酶滲入包括用一種或多于一種果膠酶、一種或多于一種纖維素酶、或者一種或多于一種果膠酶和一種或多于一種纖維素酶進行滲入。7.根據權利要求4所述的方法，其中所述螯合劑是乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇四乙酸(EGTA)。8.根據權利要求2所述的方法，其中所述生物處理包括用一種或更多種擴展蛋白、生長素或其組合進行處理。9.根據權利要求2所述的方法，其中所述酶處理包括用一種或多于一種果膠酶、一種或多于一種纖維素酶、或者一種或多于一種果膠酶和一種或多于一種纖維素酶進行處理。10.根據權利要求9所述的方法，其中所述酶組合物不包括脂肪酶、蛋白酶或果膠酶中的一種或更多種。11.根據權利要求1所述的方法，其中在所述獲取步驟(步驟a)中，用編...

【專利技術屬性】
技術研發人員：馬農·科圖雷，達尼·帕克特，路易斯菲利普·韋齊納，
申請(專利權)人：麥迪卡格公司，
類型：
國別省市：