使用多維純化方法純化植物（非動(dòng)物來源的）蛋白Ａ以除去蛋白Ａ中的不需要的非動(dòng)物來源成分的雜質(zhì)，所述蛋白Ａ來自用于制備蛋白Ａ的非動(dòng)物發(fā)酵培養(yǎng)基，以制備沒有動(dòng)物來源成分且基本上沒有來自非動(dòng)物來源生長培養(yǎng)基的成分的植物蛋白Ａ。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】不使用動(dòng)物來源成分的蛋白A的制備和純化相關(guān)申請(qǐng) 專利
本專利技術(shù)涉及植物(非動(dòng)物來源的)蛋白A的方法，其使用多維純化方 法純化以除去來自非動(dòng)物發(fā)酵培養(yǎng)基的蛋白A中的不需要的非動(dòng)物來源成 分的雜質(zhì)，從而制備沒有動(dòng)物來源成分且基本上沒有來自非動(dòng)物來源生長 培養(yǎng)基成分的植物蛋白A的方法，所述非動(dòng)物發(fā)酵培養(yǎng)基用于生產(chǎn)蛋白 A。專利技術(shù)背景蛋白A是金黃色葡萄球菌制備的細(xì)胞壁蛋白。革蘭氏陽性金黃色葡 萄球菌的免疫球蛋白結(jié)合蛋白，蛋白A與來自人、豚鼠、豬和兔的免疫 球蛋白的Fc區(qū)域很強(qiáng)地結(jié)合。參見Langone， (1982) Adv. Immunol. 32:157 和Lindmark(1983) J. Immunol. Methods 62:1。蛋白A較小程度與具有VH3 區(qū)的免疫球蛋白M (IgM)結(jié)合，而不影響免疫球蛋白對(duì)抗原的親和力。 蛋白A商業(yè)上用于純化單克隆抗體，所述抗體通常反過來用于治療人類疾 病，如炎性疾病和癌癥。而且，蛋白A自身可以用于治療。可將蛋白A給 藥病人以結(jié)合如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的自身免疫疾病中的循環(huán)免疫復(fù)合物，或刺 激感染病人中的特異性細(xì)胞因子產(chǎn)生。而且，當(dāng)與色譜樹脂偶聯(lián)時(shí)，蛋白A全血，所述病癥如自身免疫疾病和移植器官排斥反應(yīng)。在一些金黃色葡萄球菌(S.aureus)的菌抹中，蛋白A保持與細(xì)胞壁結(jié)合， 而在一些其它的(分泌的)菌抹中，蛋白A作為分子量40-55,000的可溶蛋 白產(chǎn)物進(jìn)入到生長培養(yǎng)基中。參見Lindmark, (1977) Eur. J. Biochem. 74:623。 蛋白A商業(yè)上廣泛用于生產(chǎn)單克隆抗體。可溶的和功能性蛋白A和表示蛋 白A的5個(gè)IgG結(jié)合區(qū)域中的幾個(gè)的蛋白A的功能片段已經(jīng)通過分子克隆 法制備，它們都表現(xiàn)出對(duì)IgG的親和力。 一般地，克隆在細(xì)菌中表達(dá)，所述 細(xì)菌在部分或全部動(dòng)物來源制備的培養(yǎng)基中生長，所述動(dòng)物來源如牛乳酪蛋白、哺乳動(dòng)物肉湯或培養(yǎng)液。最初，蛋白A源自金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁，但是已經(jīng)分離了分泌該蛋 白的菌株，且這些菌林也用于得到蛋白A。然而，通過常規(guī)方法制備蛋白A 在用于人類治療中存在問題。金黃色葡萄球菌在含有動(dòng)物產(chǎn)品的培養(yǎng)基中生 長，所述動(dòng)物產(chǎn)品作為細(xì)菌的氨基酸源。尤其是，通常使用牛水解產(chǎn)物和提 取物作為細(xì)菌生長培養(yǎng)基中的補(bǔ)充劑。因此，從含有動(dòng)物來源產(chǎn)物的生長培養(yǎng)基中得到的蛋白A導(dǎo)致動(dòng)物產(chǎn)品如蛋白酶?jìng)魅拘砸蜃樱偱２ ⒕d羊瘋癢病和消耗性疾病中的病原體，可能在培養(yǎng)基中出現(xiàn)并傳遞到人類病人的可能性。在下游純化過程中，蛋白A制劑也可能暴露于動(dòng)物產(chǎn)品并被動(dòng)物產(chǎn)品污 染。例如，在現(xiàn)已使用的方法中，使用IgG瓊脂糖色譜柱純化蛋白A,且偶 聯(lián)到瓊脂糖色譜柱的IgG—般為動(dòng)物來源的。然而，在分離和純化過程中伴 隨蛋白A制備出現(xiàn)的動(dòng)物產(chǎn)品不容易通過當(dāng)前已知的方法從制劑中純化。近來對(duì)于各種消耗性疾病傳播的健康關(guān)心程度已經(jīng)促使將動(dòng)物來源物 質(zhì)從細(xì)菌生長培養(yǎng)基中除去，其中任何從在這種培養(yǎng)基中生長的細(xì)菌得到產(chǎn) 品可能與人接觸，所述消耗性疾病如牛海綿樣腦病(BSE)、分類為傳遞性 海綿狀腦病(TSE)和不同克-雅二氏病(CJD)的幾種疾病中的一種、蛋白 酶?jìng)魅拘砸蜃酉嚓P(guān)疾病。因此，植物源培養(yǎng)基已經(jīng)開始取代動(dòng)物來源培養(yǎng)基 用于生長微生物，所述微生物用于生產(chǎn)最終變?yōu)樗幬镌噭┑漠a(chǎn)物，所述藥物 試劑如維生素、氨基酸或治療蛋白，如抗體。因此，需要商業(yè)上可用的方法 以生產(chǎn)和純化用于治療抗體的非動(dòng)物來源蛋白A,所述抗體必須具有高純 度，所述蛋白A的結(jié)合性質(zhì)至少與通常使用的蛋白A相等，并且需要保證 沒有動(dòng)物生長的條件和純化方法。很久以前發(fā)展的用于分離來自動(dòng)物來源微生物發(fā)酵的純化方法被設(shè)計(jì) 出來以除去在發(fā)酵過程中微生物制備的或作為一部分生長培養(yǎng)基意外加入 的不想要的成分，且其被微生物改變或剩下沒有改變的。純化領(lǐng)域中多年的 實(shí)踐使得實(shí)現(xiàn)這種純化有多種方法。然而，在如分離微生物分泌進(jìn)入培養(yǎng)基 中的可溶蛋白的情況中，許多純化方法循環(huán)出現(xiàn)以去除培養(yǎng)基成分，所述培 養(yǎng)基成分以高濃度加入以促進(jìn)所感興趣的產(chǎn)物的生長和有效生產(chǎn)。在改變培 養(yǎng)基成分的事件中，將可能出現(xiàn)新型的污染，因此需要將它們從所感興趣的 產(chǎn)物中去除。然而，它們不可以通過從以前培養(yǎng)基分離發(fā)展的方法純化出來。 因此，從動(dòng)物來源生長培養(yǎng)基到非動(dòng)物來源培養(yǎng)基成分的改變引入了一系列對(duì)純化方法的挑戰(zhàn)，如培養(yǎng)基成分的溶解度、糖含量、脂質(zhì)含量、蛋白含量、 微粒、粘度等的差異。這些中每個(gè)都與以前用于動(dòng)物來源生長培養(yǎng)基發(fā)酵和 生長發(fā)展的方法的速度、效率和效果有關(guān)。來自動(dòng)物來源的蛋白A通常通過兩種方法之一純化，"經(jīng)典"的方法是使用 一些陰離子交換柱和/或空間排阻柱(size exclusive column)或親和層析柱 的組合，使用純化的免疫球蛋白(動(dòng)物來源)共價(jià)連接到不溶基質(zhì)上，如瓊 脂糖或二氧化硅。為了制備沒有動(dòng)物來源污染的蛋白A產(chǎn)品，除去任何來自 其最近經(jīng)歷和來自發(fā)酵過程并且也來自純化過程的動(dòng)物來源產(chǎn)物是必要的。 因此，在獨(dú)特的非動(dòng)物來源培養(yǎng)基中分離生長有機(jī)體的原種培養(yǎng)物，在非動(dòng) 物來源培養(yǎng)基中生長微生物和使用非動(dòng)物來源基質(zhì)純化蛋白A產(chǎn)物，使得達(dá) 到?jīng)]有污染細(xì)菌蛋白和來自培養(yǎng)基的成分的程度是必要的。球菌中純化蛋白A,從而得到了高純度的典型的蛋白產(chǎn)物，其純度通過SDS 凝膠電泳和用于蛋白A的帶有典型UV光譜的分析色譜檢測(cè)(參見Sjoquist, (1972) Eur. J. Biochem. 29:572)。在l-10mg/mL的濃度下，溶液接近無色。 然而，在我們最初試驗(yàn)時(shí)，使用在非動(dòng)物來源培養(yǎng)基上生長和通過相同方法 純化的金黃色葡萄球菌，蛋白A產(chǎn)物呈黃色，并且吸收基本上在高UV和可 見區(qū)域(300-450nm),但是在SDS凝膠電泳上得到相同的圖譜，此表明其 純度很高。這表明存在非蛋白污染物。事實(shí)上，l-5mg/mL的這種蛋白A的 溶液明顯為黃褐色， 一種類似于稀釋生長培養(yǎng)基樣式的顏色。因此，明顯的 現(xiàn)有純化方法沒有除去所有非動(dòng)物來源生長培養(yǎng)基成分。因此，需要提供新 的、提高的用于純化植物源蛋白A的純化方法。專利技術(shù)簡述本專利技術(shù)提供了非動(dòng)物來源蛋白A的純化方法，其包括(a) 提供非動(dòng)物來源蛋白A溶液，其通過在含有植物氨基酸或肽的培養(yǎng) 基中發(fā)酵金黃色葡萄球菌的分泌菌抹而制備，所述培養(yǎng)基不含有動(dòng)物產(chǎn)品；(b) 將過濾后的蛋白A溶液加樣到第一柱子上；(c) 用緩沖劑-鹽混合物洗滌柱子以將不需要的顏色和污染蛋白沖洗出 柱子；(d) 從第一柱子洗脫出蛋白A以制備蛋白A溶液合并物；(e) 調(diào)節(jié)蛋白A溶液合并物的pH和電導(dǎo)率；(f) 將來自蛋白A溶液合并物的蛋白A加樣到第二柱子上；(g) 用緩沖劑-鹽混合物洗滌第二柱子以將不需要的顏色和污染蛋白沖 洗出沖主子；和(h) 將蛋白A從第二柱子洗脫出來以制備純化的蛋白A溶液； 其中所述第一柱子選自(l)陰離子交換柱、HIC柱和陶瓷羥基磷灰石柱 (ceramic hydroxyapatite column),或(2)P曰離子交換柱；且當(dāng)所述第一柱子選 自陰離子交換柱、HIC柱和陶瓷羥基磷灰石柱時(shí)，所述第二柱子為陽離子交 換柱，且當(dāng)所述第一柱子為陽離子交換柱時(shí)，所述第二柱子選自陰離子交換 柱、HIC柱和陶乾羥基磷灰石柱。本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
非動(dòng)物來源的蛋白Ａ的純化方法，其包括： （ａ）提供非動(dòng)物來源蛋白Ａ溶液，所述溶液通過在含有植物氨基酸或肽的培養(yǎng)基中發(fā)酵金黃色葡萄球菌的分泌菌株而制備，所述培養(yǎng)基不含有動(dòng)物產(chǎn)品； （ｂ）將過濾后的蛋白Ａ溶液加樣到第一柱子上； （ｃ）用緩沖劑－鹽混合物洗滌柱子以將不需要的顏色和污染蛋白沖洗出柱子； （ｄ）從第一柱子洗脫出蛋白Ａ以制備蛋白Ａ溶液合并物； （ｅ）調(diào)節(jié)蛋白Ａ溶液合并物的ｐＨ和電導(dǎo)率； （ｆ）將來自蛋白Ａ溶液合并物的蛋白Ａ加樣到第二柱子上； （ｇ）用緩沖劑－鹽混合物洗滌第二柱子以將不需要的顏色和污染蛋白沖洗出柱子；和 （ｈ）將蛋白Ａ從第二柱子洗脫出來以制備純化的蛋白Ａ溶液； 其中所述第一柱子選自（１）陰離子交換柱、ＨＩＣ柱和陶瓷羥基磷灰石柱，或（２）陽離子交換柱；且當(dāng)所述第一柱子選自陰離子交換柱、ＨＩＣ柱和陶瓷羥基磷灰石柱時(shí)，所述第二柱子為陽離子交換柱，且當(dāng)所述第一柱子為陽離子交換柱時(shí)，所述第二柱子選自陰離子交換柱、ＨＩＣ柱和陶瓷羥基磷灰石柱。
【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：南都德奧卡，郭為，史蒂夫馬吉，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：馬林克羅特貝克公司，
類型：發(fā)明
國別省市：US[美國]
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