病毒性出血性敗血癥病毒的RT-PCR檢測試劑盒及其制備方法，涉及一種RT-PCR檢測試劑盒。所述病毒性出血性敗血癥病毒的RT-PCR檢測試劑盒設有盒體、操作說明書和檢測試劑；操作說明書和檢測試劑設在盒體內，所述檢測試劑包括裂解液、吸附液、洗滌液、DEPC處理水、反轉錄反應液、VHSV-PCR反應液、陽性對照和陰性對照。制備盒體；配制檢測試劑；將操作說明書、裂解液、吸附液、洗滌液、DEPC處理水、反轉錄反應液、VHSV-PCR反應液、陽性對照和陰性對照置入盒體內，即得病毒性出血性敗血癥病毒的RT-PCR檢測試劑盒。試劑齊全，操作簡單。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種RT-PCR檢測試劑盒，尤其是涉及病毒性出血性敗血癥病毒(Viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)的 RT-PCR 檢測試劑盒及其制備方法。
技術介紹
病毒性出血性敗血癥(Viral hemorrhagic septicemia, VHS)是感染鮭類、蹲魚、大菱鲆、鱸魚、漠斑牙鲆、褐鱒、茴魚等多種魚類的一種致死性傳染性疾病。該病導致魚皮膚、腎臟和肝臟出血，死亡率約為90%。VHS的病原是病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV)，屬于彈狀病毒科Novirhabdovirus屬。VHSV基因組為一段單鏈負鏈RNA，其長度約12kp，線性基因組編碼5個蛋白，包括:核衣殼蛋白(N蛋白)，兩個結構蛋白(P和M蛋白)，糖蛋白(G蛋白)、RNA聚合酶(L蛋白)和一個非結構蛋白(NV蛋白)，順序為3’ -Leader-N-P-M-G-NV-L-TraiIer-5’。VHSV病毒粒子長約180nm，寬約70nm。在國際動物衛生組織和我國進境動物一、二類傳染病名錄中均被列為必報疫病。國際組織通常采用一些限制措施，從而避免染病魚類流動到其他地區和國家，過去VHS主要流行于北美洲和歐洲一些國家。近年來，隨著水生動物及其產品進出口貿易的急劇增加，VHSV已經傳入我國，并在我國局部地區流行。逆轉錄鏈式聚合酶反應(RT-PCR)是一種用于檢測病毒和類病毒最常用的方法，已經應用到了一系列魚病病毒的檢測中，包括:昏睡病虹彩病毒(Sleeping diseasevirus)、大馬哈魚傳染性貧血癥病毒(Infectious salmon anaemia virus)、水生呼腸孤病毒屬(Fish aquareovirus)、敗血癥病毒(Hemopoietic necrosis virus)。病毒性出血性敗血癥病毒致死率非常高，給網箱養殖造成巨大的經濟損失。防治病毒感染最有效的方式是防止接觸病毒，有規律地進行常規檢查，在魚類運輸前后，進行更嚴格的檢測。原則上避免接觸感染的養殖場，使用無病毒感染的餌料喂食，使用無病毒的養殖水體，使用經檢測的魚卵是控制VHSV的最有效措施。目前還沒有一種有效的治療方法，因此在感染初期檢測病毒就顯得非常重要。這就需要一種成本低、快速、特異性與靈敏度高的檢測方法。在過去的幾十年里，已經建立了幾種檢測病毒性出血性敗血癥病毒的方法。傳統標準的檢測方法是首先通過細胞培養分離出病毒，再使用特異方法如免疫熒光單抗(IFAT)或者抗體中和試驗檢測([ll]Fregeneda_GrandesJM，Olesen NJ.Detection ofrainbow trout antibodies against viral haemorrhagicsepticaemia virus (VHSV) byneutralisation test is highly dependent on the virus isolate used.Dis AquatOrgan, 2007，74(2): 151-158)。我國2008年由國家質量監督檢驗檢疫總局發布的國標GB/T15805.3-2008中，也采用了該方法。目前常用的還有酶聯免疫吸附法([12]EncinasP，Gomez-Casado E, Estepa A,Coll JM.An ELISA for detection of trout antibodies toviral haemorrhagic septicemia virus using recombinant fragments of their viralG protein.J Virol Methods, 176 (1-2): 14-23)和實時定量 RT-PCR ([13] Chico V, Gomez N, Estepa A, Perez L.Rapid detection and quantitation of viral hemorrhagicsepticemia virus in experimentally challenged rainbow trout by real-timeRT-PCR.J Virol Methods, 2006, 132 (1-2): 154-159)。但這些方法有的耗時長，有的要求使用昂貴的設備和試劑。RT-PCR技術是一種快速、特異性好和靈敏高的病毒檢測方法，廣泛的應用于餌料、養殖水體和環境監測中。以前也有關于VHSVRT-PCR檢測方法的報道，但是只報道了特異性引物，沒有形成試劑盒，操作時需要購買大量配套試劑，過程繁瑣。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供可特異性檢測病毒性出血性敗血癥病毒的引物。本專利技術的另一個目的在于提供一種病毒性出血性敗血癥病毒的RT-PCR檢測試劑盒及其制備方法。根據已公開的病毒性出血性敗血癥病毒基因組序列，選取病毒性出血性敗血癥病毒的核蛋白基因序列，進行分析設計，所述可特異性檢測病毒性出血性敗血癥病毒的引物為:VHSN-F:其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；VHSN-F:其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。所述病毒性出血性敗血癥病毒的RT-PCR檢測試劑盒設有盒體、操作說明書和檢測試劑；操作說明書和檢測試劑設在盒體內，所述檢測試劑包括裂解液、吸附液、洗滌液、DEPC處理水、反轉錄反應液、VHSV-PCR反應液、陽性對照和陰性對照。所述病毒性出血性敗血癥病毒的RT-PCR檢測試劑盒的制備方法如下:I)制備盒體； 2)配制檢測試劑:裂解液為:5mol/L鹽酸胍,0.lmol/L EDTA,去離子水定容至1L, pH為8.0 ；吸附液為:將5g玻璃粉放在25 30mL水中懸浮，然后再加入等體積的硝酸反應，最后重新加水懸浮即可，所述硝酸的濃度可為68% ；洗漆液為:0.lmol/L氯化鈉，lmmol/L EDTA, 10mmol/L Tris-HCl,去離子水定容至1L，pH為7.5，再加入等體積的無水乙醇；DEPC (焦碳酸二乙酯)處理水:往超純水中加入DEPC至終濃度為0.1%，振蕩2h后，高溫高壓滅菌2次；反轉錄反應液:每6 ii L反轉錄反應液含有I ii L50mM VHSN-R引物；1 y L dNTP混合物，每種 dNTP 濃度為 IOmM ;2 y L5 XPrimescript 緩沖液；0.25 u L RNase 抑制劑；0.25 u L逆轉錄酶，購自中國大連寶生物公司；0.3iiL甘油；1.2iiL DEPC處理水；VHSV-PCR 反應液:每 18 ii L VHSV-PCR 反應液含有 I U LlOmM VHSN-F 引物；I u LlOmM VHSN-F 引物；1 y L dNTP 混合物，每種 dNTP 濃度為 2.5mM ；0.25 u L Taq DNA聚合酶；2UL10XPCR緩沖液；L5iiL甘油；lL25yL雙蒸水；陰性對照:DEPC處理水；陽性對照:將體外轉錄得到的VHSV核蛋白基因RNA片段稀釋到IO4拷貝/ U L所得溶液；3)將操作說明書、裂解液、吸附液、洗滌液、DEPC處理水、反轉錄反應液、VHSV-PCR反應液、陽性對照和陰性對照置入盒體內，本文檔來自技高網...
【技術保護點】
可特異性檢測病毒性出血性敗血癥病毒的引物，其特征在于所述引物為：VHSN?F：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；VHSN?F：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。
【技術特征摘要】
1.可特異性檢測病毒性出血性敗血癥病毒的引物，其特征在于所述引物為: VHSN-F:其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示； VHSN-F:其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。2.病毒性出血性敗血癥病毒的RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于設有盒體、操作說明書和檢測試劑；操作說明書和檢測試劑設在盒體內，所述檢測試劑包括裂解液、吸附液、洗滌液、DEPC處理水、反轉錄反應液、VHSV-PCR反應液、陽性對照和陰性對照。3.如權利要求2所述病毒性出血性敗血癥病毒的RT-PCR檢測試劑盒的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)制備盒體； 2)配制檢測試劑: 裂解液為:5mol/L鹽酸胍，0.lmol/L EDTA，去離子水定容至1L，pH為8.0 ; 吸附液為:將5g玻璃粉放在25 30mL水中懸浮,然后再加入等體積的硝酸反應,最后重新加水懸浮即可； 洗洚液為:0.lmol/L氯化鈉，lmmol/L EDTA, 10mmol/L Tris-HCl,去離子水定容至1L,pH為7.5，再加入等體積的無水乙醇； DEPC處理水:往超純水中加入DEPC至終濃度為0.1%，振蕩2h后，高溫高壓滅菌2次；反轉錄反應液:每6 ii L反轉錄反應液含有I U L50mM VHSN-R引物；1 y L dNTP混合物，每種 dNTP 濃度為 IOmM ；2 u L5 XPrimescript 緩沖液；0.25 u L RNase 抑制劑；0.25 y L 逆轉錄酶，購自中國大連寶生物公司；0.3iiL甘油；1.2iiL DEPC處理水； VHSV-PCR 反應液:每 18 ii L VHSV-PCR 反應液含有 I U LlOmM VHSN-F 引物；I u LlOmMVHSN-F 引物；I ii L dNTP 混合物，每種 dNTP 濃度為 2.5mM ；0.25 u L Taq DNA 聚合酶；2 ii LlO X PCR 緩沖液；1.5iiL 甘油；11.25iiL 雙蒸水； 陰性對照=DEPC處理水； 陽性對照:將體外轉錄得到的VHSV核蛋白基因RNA片段稀釋到IO4拷...
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳新華，胡國海，敖敬群，母尹楠，
申請(專利權)人：國家海洋局第三海洋研究所，
類型：發明
國別省市：
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