本發明專利技術涉及一種用于辣椒輕斑駁病毒反轉錄-環介導等溫擴增檢測的引物、檢測方法及其應用，所述引物為PMMoV-F3、PMMoV-B3、PMMoV-FIP和PMMoV-BIP，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1～4所示。本發明專利技術還進一步提供了檢測辣椒輕斑駁病毒的方法，該方法以樣品總RNA為模板，利用本發明專利技術特異性引物進行RT-LAMP擴增，判斷樣品中是否含有辣椒輕斑駁病毒。本發明專利技術引物特異性好，檢測方法快速準確，靈敏度高，適合于進出境植物檢疫、種子健康檢查及農業生產上辣椒輕斑駁病毒的快速檢測診斷，應用前景廣泛。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物檢測技術，具體地說涉及辣椒輕斑駁病毒反轉錄-環介導等溫擴增(RT-LAMP )檢測引物、檢測方法及其應用。
技術介紹
辣椒輕斑駁病毒virus, PMMoV)是一種正單鏈RNA的桿狀病毒,屬于桿狀病毒科(Kirgaririt/ae)、煙草花葉病毒屬(TbAaffiorirw1S)成員，在世界范圍內廣泛分布，是辣椒上最重要的可經種子傳播的病原之一。PMMoV雖然在辣椒葉片上產生輕微或沒有產生癥狀，但能引起果實退綠斑駁、畸型、變小，偶爾壞死，嚴重影響辣椒的產量和品質。此外，該病毒還可能是一個能夠同時感染人類的植物病毒，已有報道指出該病毒與人的發熱、腹部疼痛、瘙癢有關，并引起免疫反應。在我國，1989年報道在遼寧的辣椒上發生，1994年報道在新疆石河子辣椒上危害，而后發生危害的報道很少。但近5年來，先后在陜西、北京、寧夏、山東青島、河北保定等地的辣椒上發現該病毒，具有危害地區越來越廣、危害面積也在逐年增加 的趨勢。環介導等溫擴增(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)是一種在等溫條件下高特異性、高靈敏性、快速地擴增DNA的核酸擴增方法。與傳統的分子檢測方法相比，該方法具有以下幾個方面的優點:I)一般情況下，LAMP方法比傳統的PCR方法具有更高的靈敏度高；2)由于LAMP通過4對引物與靶序列上的6個特異部位準確結合來產生擴增效應，因此能獲得比PCR更高的特異性；3)LAMP是恒溫擴增反應，沒有PCR反應中溫度變化的耗時，通常在30 min-60 min內即可完成反應過程；4)LAMP反應只需要恒溫孵育器(或恒溫水浴槽)，設備簡單，不需要更為昂貴的PCR儀；5)產物檢測便捷多樣，即可根據反應體系中是否形成白色的焦磷酸鎂沉淀來定性判斷，也可加入染料后進行顏色反應判定，或瓊脂糖凝膠電泳判定，或利用LAMP實時濁度儀或實時熒光PCR系統進行實時檢測判定。LAMP自從2000年誕生以來，已在植物病害檢測中得到越來越廣泛的應用，包括植物病原細菌、病毒、寄生蟲等有害生物、轉基因的檢測中。目前，除了利用傳統的鑒別寄主、生理生化特征、電鏡技術等常規方法進行PMMoV的檢測鑒定外，還可以利用已建立的RT-PCR、實時熒光RT-PCR、基于DIG標記cDNA探針的分子雜交等分子檢測方法，但還沒有有關RT-LAMP方法的報道。本專利技術根據PMMoV基因組序列的保守區域設計引物，經條件優化后，建立了 PMMoV的RT-LAMP方法，為PMMoV的快速檢測提供一種新的分子檢測方法。
技術實現思路
本專利技術目的在于提供用于辣椒輕斑駁病毒RT-LAMP檢測的引物序列及其應用。所述RT-LAMP檢測，即辣椒輕斑駁病毒反轉錄-環介導等溫擴增檢測。本專利技術的目的是通過以下方法實現的。本專利技術通過分析已報道的PMMoV基因序列，設計特異性引物。所述的引物對由I對外引物和I對內引物組成，其外引物序列為PMMoV-F3:如SEQ ID NO:1所示，即為 5’ - CAGGTGGACTTCGGTCTT -3’、PMMoV-B3:如 SEQ ID NO:2 所示，即為 5’ -CAAGCTTTGAAAGGTACAGT -3，;其內引物為 PMMoV-FIP:如 SEQ ID NO:3 所示，即為 5’- ATTTCCCCCGATATCATATGTCGTGGAACTAGAATACTTGATGATGC-3，、PMMoV-BIP:如 SEQ ID NO:4 所示，即為 5，- GTCGTGACTACGTTCATTGCTGTCAATGCTATCCTTTTGAGC-3，。本專利技術還進一步提供了應用上述引物的RT-LAMP檢測方法，其以樣品總RNA為模板，進行RT-LAMP擴增，反應結束后根據是否產生典型的梯狀條帶判定結果。本專利技術的反應條件可由兩步RT-LAMP法或一步RT-LAMP法進行，其特征在于: (1)兩步RT-LAMP法的反轉錄反應和LAMP擴增反應兩個過程分開進行，反轉錄反應的溫度為42°C，LAMP擴增溫度為65 V ； (2)—步RT-LAMP法的反轉錄反應和LAMP擴增反應同時進行，一步RT-LAMP法的反應溫度為60 °C。RNA 反轉錄體系為 20 μ L，4.0 μ L 總 RNA, 2 μ L PMMoV-CP2 (10 μ mol/L), 5.0 μ LDEPC處理水，70°C水浴5 min,冰浴5 min后加入4 μ L 5 XM-MLV緩沖液，0.5 μ L M-MLV反轉錄酶(200 U/μ L), I μ L dNTP (各 10 mmol/L)，0.5 μ L Ribolock RNase Inhibitor(40 U/μ L)，補充DEPC處理水至20 μ L，輕輕混勻后42°C水浴lh，70 °C滅活10 min，合成第一鏈cDNA，-20 °C保存備用。LAMP反應體系為25 μ L，包括DNA聚合酶大片段(8 U/μ L)l.0 μ L, IOXfeiDNA聚合酶緩沖液2.5 yL，cDNA模板2 μ L, MgS04( 100 mmol/ L)1 μ L，甜菜堿(Betaine)(5 mol/L) 5 μ L, dNTP (10 mmol/L) I μ L, 10 μ mol/L PMMoV-FIP 和 BIP 各 4 μ L, 10μ mol/L PMMoV_F3和Β3各0.5 μ L，加滅菌水補充至25 μ L。反應條件為65 °C孵育I h。取5 μ L擴增產物在1.5%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，然后在凝膠成像儀上觀察、拍照。一步RT-LAMP反應體系為25 μ L，包括0.5 μ L的M-MLV反轉錄酶(200 U/μ L)或 0.125 UL 的 AMV 反轉錄酶(10 U/μ L)，沒s DNA 聚合酶大片段(8 U/μ L)l.0 yL,10X緩沖液 2.5 μ L,0.5 μ L Ribolock RNase Inhibitor (40 U/μ L),2 μ L 總 RNA，MgS04(100 mmoI / L) I μ L，甜菜喊(Betaine) (5 mol/L) 5 μ L, dNTP (10 mmol/L) I μ L, 10μ mol/L PMMoV-FIP 和 BIP 各 4 μ L, 10 μ mol/L PMMoV-F3 和 Β3 各 0.5 μ L,加滅菌水補充至25 μ L0反應條件為60 °C孵育I h。取5 μ L擴增產物在1.5%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，然后在凝膠成像儀上觀察、拍照。進一步，還可以將本專利技術引物及相關試劑組裝成試劑盒，以方便使用。所述的引物在辣椒輕斑駁病毒檢測中的應用不限于以上所述，例如把反轉錄和LAMP擴增組成一步RT-LAMP檢測方法。本專利技術具有以下優點:本專利技術根據辣椒輕斑駁病毒基因組序列設計引物，該組引物可用于辣椒輕斑駁病毒RT-LAMP檢測。本專利技術檢測方法能夠快速準確地判斷樣品是否有辣椒輕斑駁病毒，為進出口安全提供了保證。 附圖說明圖1是辣椒輕斑駁病毒RT-LAMP方法的不同分離物檢測結果。M:DNA Marker ；I為Agdia的PMMoV陽性對照樣品(Lot NO:C168本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種辣椒輕斑駁病毒RT?LAMP檢測引物，由PMMoV?F3、PMMoV?B3、PMMoV?FIP和PMMoV?BIP引物組成，其特征在于核苷酸序列為：PMMoV?F3：5’??CAGGTGGACTTCGGTCTT??3’PMMoV?B3：5’??CAAGCTTTGAAAGGTACAGT??3’PMMoV?FIP?：5’??ATTTCCCCCGATATCATATGTCGTGGAACTAGAATACTTGATGATGC??3’PMMoV?BIP?：5’??GTCGTGACTACGTTCATTGCTGTCAATGCTATCCTTTTGAGC?3’。
【技術特征摘要】
1.一種辣椒輕斑駁病毒RT-LAMP檢測引物，由PMMoV-F3、PMMoV_B3、PMMoV-FIP和PMMoV-BIP引物組成，其特征在于核苷酸序列為:PMMoV-F3:5’ _ CAGGTGGACTTCGGTCTT _3’PMMoV-B3:5’ _ CAAGCTTTGAAAGGTACAGT _3’PMMoV-FIP:5’ - ATTTCCCCCGATATCATATGTCGTGGAACTAGAATACTTGATGATGC -3’PMMoV-BIP:5’ - GTCGTGACTACGTTCATTGCTGTCAATGCTATCCTTTTGAGC-3’。2.一種利用權利要求1檢測引物檢測辣椒輕斑駁病毒的RT-LAMP方法，...
【專利技術屬性】
技術研發人員：黃天培，廖富榮，關雄，方志鵬，吳媛，郭木金，
申請(專利權)人：福建農林大學，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。