具有抑制腦膠質瘤細胞遷移與侵襲功能的DNA片段及其應用制造技術

本發明專利技術涉及一種具有抑制腦膠質瘤細胞遷移與侵襲功能的DNA片段及其應用。該DNA片段為SEQNO1所示的堿基序列。本發明專利技術設計DIAPH1基因的干擾質粒，并應用腦膠質瘤細胞模型研究其對細胞遷移和侵襲的抑制作用，為膠質瘤的治療應用提供了一種新方法。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種具有抑制腦膠質瘤細胞遷移與侵襲功能的DNA片段及其應用。
技術介紹
腦膠質瘤(Gliolma)是起源于中樞神經系統的一種常見的惡性腫瘤，其特點為侵潤性生長，與正常的腦組織無明顯界限，多數不限于一個腦葉，向腦組織外呈指狀深入破壞腦組織，其發病率約占成人顱內腫瘤的35% 60%。近年來，因其預后差、病死率高等特點使得單純手術治療惡性腦膠質瘤的存活率很低。患有惡性腦膠質瘤的病人通常預后很差，特別是老年人，在美國，每年大約有10，000人會患此病，但50%的病人在治療之后的平均存活時間也不到12個月，面臨這種現狀，研究一種對惡性腦膠質瘤有效的治療體系迫在眉睫。DIAPHl是屬于果蠅透明基因的一種同源性基因。其表達的蛋白因具有成蛋白同源結構域rai和m2而從屬于成蛋白家族，在應力纖維，絲狀偽足，黏著斑，微管的形成中起重要作用。同時該蛋白作為肌動蛋白成核因子，它參與了眾多以肌動蛋白為基礎的生物學過程，包括形態發生、胞質分裂、細胞極性的形成、細胞黏附和運動等，并常在病理情況下如腫瘤分化、侵襲和轉移中表達失調。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是指由雙鏈RNA介導的細胞內與其序列同源的mRNA發生特異性降解，從而導致基因表達沉默的現象，這是一種轉錄后水平的基因沉默機制。
技術實現思路
本專利技術的目的之一在于提供一種具有抑制腦膠質瘤細胞遷移與侵襲功能的DNA片段。 本專利技術的目的之二在于提供含有該DNA片段的干擾質粒。本專利技術的目的之三在于提供該干擾質粒的制備方法。本專利技術的目的之四在于提供該DNA片段在制備治療腦膠質瘤藥物中的應用。為達到上述目的，本專利技術采用如下技術方案: 一種具有抑制腦膠質瘤細胞遷移與侵襲功能的DNA片段，其特征在于該DNA片段為SEQID N0.1所不的喊基序列。一種制備上述的具有抑制腦膠質瘤細胞遷移與侵襲功能的DNA片段的方法，其特征在于該方法的具體步驟為:根據pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector Kit中的設計要求，設計對應于DIAPHl基因的干擾DNA片段，S卩GGA ACA AGC ATG AGA TCA TTC的shRNA的寡核苷酸序列，各為62bp。一種干擾質粒，其特征在于該質粒含有上述的片段。一種制備上述的干擾質粒的方法，其特征在于該方法的具體步驟為:根據PGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector Kit基因質粒構建試劑盒中載體設計的具體要求,將上述的shRNA的寡核苷酸序列引物和pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector進行連接，得到DIAPHl基因的干擾質粒。一種上述的用于抑制腦膠質瘤細胞遷移與侵襲的DNA片段在制備治療腦膠質瘤藥物中的應用。本專利技術設計DIAPHl基因的干擾質粒，并應用腦膠質瘤細胞模型研究其對細胞遷移和侵襲的抑制作用，為膠質瘤的治療應用提供了一種新方法。附圖說明圖1 為 pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector 圖。圖2為Western blot分析腦膠質瘤細胞系U87中DIAPHl的蛋白表達量變化。其中None為:未轉染對照組；NC為:陰性對照組；RNAi為:轉染DIAPHl基因干擾質粒組。圖3 為 Radius 24-Well Cell Migration Assay 分析腦膠質瘤細胞系 U87 遷移的能力。其中None為:未轉染對照組；NC為:陰性對照組；RNAi為:轉染DIAPHl基因干擾質粒組。圖4為 BD BioCoat Matrigel Invasion Chamber分析腦膠質瘤細胞系U87侵襲的能力。其中A為:未轉染對照組出為:陰性對照組;C為:轉染DIAPHl基因干擾質粒組；D為:統計分析圖，其中None為:未轉染對照組；NC為:陰性對照組；RNAi為:轉染DIAPHl基因干擾質粒組。具體實施例方式一、腦膠質瘤細胞系U87的培養:腦膠質瘤細胞系U87培養于37°C，5%C02恒溫培養箱。當細胞進入對數生長期時，吸去培養皿中的舊培養液，用2ml無菌Hanks清洗，以除去含有胰蛋白酶抑制劑的血清，加入Iml 0.05%Trypsin-EDTA-D-Hanks溶液于培養皿中，370C，5%C02培養箱中放置2min，然后在顯微鏡下觀察細胞是否分離皿壁(如未分離完全，可適當延長胰酶消化的時間，直至基本完全分離)；加入2ml新鮮培養液，用槍輕輕吹打，再加入適量培養液以易于混勻細胞；取Iml細胞懸液加入裝有2ml新鮮培養基的新培養皿中，放入37°C，5%C02培養箱中培養，約3天左右傳代I次(主要看細胞有無鋪滿細胞培養皿)。 二、DIAPHl基因干擾質粒與陰性對照質粒的設計和轉染:根據pGPU6/GFP/Neo siRNAExpression Vector Kit中設計的具體要求，設計對應于DIAPHl基因(GGA ACA AGC ATGAGA TCA TTC)的shRNA的寡核苷酸序列，各為62bp，并進行合成。該shRNA的寡核苷酸序列為:Sense: 5’- CAC CGG AAC MG CAT GAG ATC ATT CTT CAA GAG AGA ATG ATC TCA TGCTTG TTC CTT TTT TG-3’Ant1-sense::5’ - gaT CCA AAA AAG GAA CAA GCA TGA GAT CAT TCT CTC TTG AAGAAT GAT CTC ATG CTT GTT CC-3’ ； 根據pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector Kit中設計的具體要求,設計陰性對照，即不會干擾細胞中任何基因表達(GTT CTC CGA ACG TGT CAC GT)的shRNA的寡核苷酸序列引物，各為59bp， 并進行合成。陰性對照的shRNA對應的序列為:Sense: 5’- CAC CGT TCT CCG AAC GTG TCA CGT CM GAG ATT ACG TGA CAC GTT CGGAGA ATT TTT TG-3’Ant1-sense::5’_GAT CCA AAA AAT TCT CCG AAC GTG TCA CGT AAT CTC TTG ACG TGACAC GTT CGG AGA AC-3， 根據pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector Kit中設計的具體要求,將前面設計的兩種shRNA的寡核苷酸序列分別和pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector連接,然后分別轉染腦膠質瘤細胞系U87。轉染前一天，將細胞接種至24孔細胞培養板上，用不含抗生素的DMEM培養基培養，待細胞匯合度達到60%-70 %時，進行FuGENE HD Transfection Reagent介導的DNA轉染。100 μ I不含血清的無抗DMEM培養基稀釋2 μ g質粒，輕輕混合；隨后稀釋3 μ IFuGENE HD Transfection Reagent到上述已加入質粒的100 μ I DMEM無抗無血清培養基中，輕輕本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種具有抑制腦膠質瘤細胞遷移與侵襲功能的DNA片段，其特征在于該DNA片段為SEQ?ID?NO.1所示的堿基序列。

【技術特征摘要】
1.一種具有抑制腦膠質瘤細胞遷移與侵襲功能的DNA片段，其特征在于該DNA片段為SEQ ID N0.1所不的喊基序列。2.一種制備根據權利要求1所述的具有抑制腦膠質瘤細胞遷移與侵襲功能的DNA片段的方法，其特征在于該方法的具體步驟為:根據pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression VectorKit中的設計要求，設計對應于DIAPHl基因的干擾DNA片段，S卩GGA ACA AGC ATG AGA TCATTC的shRNA的寡核苷酸序列，各為62bp。3.一種干擾質粒，其特征...

【專利技術屬性】
技術研發人員：徐亞明，張燦，王丹，陳付學，
申請(專利權)人：上海大學，
類型：發明
國別省市：