一種植物啟動子及其應用制造技術

本發明專利技術公開了一種植物啟動子及其應用。本發明專利技術所提供的啟動子是如下1）-3）中任一種：1）序列表中序列1所示的DNA分子；2）在嚴格條件下與1）限定的DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子；3）與1）或2）限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA分子。實驗證明，本發明專利技術提供的啟動子可以驅動目的基因在植物的根、葉及花組織中表達。本發明專利技術有助于促進人們對擬南芥發育生長的研究，且為植物特別是十字花科的蔬菜花卉的遺傳改造提供了一條經濟、快速、有效的途徑。本發明專利技術在農業領域具有廣闊的應用空間和市場前景。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種植物啟動子及其應用，特別涉及一種能驅動基因在擬南芥的根、葉及花器官表達的啟動子。
技術介紹
擬南芥(Arabidopsis thaliana)屬于十字花科植物,被廣泛用于植物分子生物學、發育生物學、和遺傳學的研究，因為其生長世代時間短、基因組小等特點使其成為了一種典型的模式植物。bHLH (basic/helix-loop-helix)蛋白是植物中的一大類轉錄因子,其關鍵結構域含有約60個較保守的氨基酸。bHLH因子可以識別基因組上的保守序列，進而在動植物及一些高等真核生物的基因轉錄調控中起作用。在擬南芥中至少含有130個編碼bHLH蛋白的基因，這些基因在調控植物的生長發育，抗逆、響應激素等方面都起著重要的作用。啟動子(Promoter)是基因組基因的一個重要組成部分，它像“開關”一樣，在轉錄水平上基本決定其控制下的編碼基因是否表達、何時表達、何處表達和表達強度。因此，對擬南芥bHLH蛋白的編碼基因及其啟動子的克隆將具有十分重要意義。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種具有啟動子功能的DNA分子。本專利技術所提供的DNA分子，來源于擬南芥(Arabidopsis thaliana)品種Columbia-O生態型,為如下I) _3)中任一種: I)序列表中序列I所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子；3)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA分子。上述嚴格條件可為在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC，0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。序列表中序列I由2502個核苷酸組成。含有所述DNA分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌均屬于本專利技術的保護范圍。在本專利技術的中，所述重組載體為在pCAMBIA1391Z載體的多克隆位點插入所述DNA分子得到的重組質粒；所述多克隆位點具體為Pst I和BamH I。所述表達盒可以由具有啟動子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子啟動表達的目的基因，以及轉錄終止序列組成；所述DNA分子以功能性方式與所述目的基因連接，且所述目的基因與所述轉錄終止序列連接。在本專利技術的一個實施例中，所述目的基因具體為⑶S基因(來源于pCAMBIA1391Z載體)；所述轉錄終止序列具體為NOS轉錄終止子(來源于pCAMBIA1391Z載體)。所述DNA分子在啟動目的基因在植物表達中的應用也屬于本專利技術的保護范圍。在本專利技術中，所述植物為十字花科植物；所述十字花科植物具體為擬南芥(如擬南芥 Columbia-0)。在上述應用中，所述表達為在如下三個器官至少一種中的表達:根、葉和花。利用所述DNA分子培育轉基因植物的方法也屬于本專利技術的保護范圍，該方法包括如下步驟:I)構建目的基因重組表達載體:將目的基因插入攜帶有所述DNA分子的所述重組載體，使所述DNA分子啟動所述目的基因表達，得到目的基因重組表達載體；2)將步驟I)構建的目的基因重組表達載體導入目的植物中，得到表達所述目的基因的轉基因植物。在本專利技術中，所述植物為十字花科植物；所述十字花科植物具體為擬南芥(如擬南芥 Columbia-0)。在上述方法中，所述表達為在如下三個器官至少一種中的表達:根、葉和花。將所述目的基因重組表達載體導入所述目的植物的方法可為農桿菌介導法、Ti質粒法、Ri質粒法、植物病毒載體法、直接DNA轉化法、顯微注射法、電導法等，在本專利技術的實施例中具體采用的為農桿菌介導法。另外，擴增所述DNA分子全長或任一片 段的引物也屬于本專利技術的保護范圍。本專利技術提供的啟動子可以驅動目的基因在植物的根、葉及花組織中表達。本專利技術有助于促進人們對擬南芥發育生長的研究，且為植物特別是十字花科的蔬菜花卉的遺傳改造提供了一條經濟、快速、有效的途徑。本專利技術在農業領域具有廣闊的應用空間和市場前旦-5^ O附圖說明圖1為在重組表達載體pCAMBIA1391Z-bHLH pro-GUS中，插入bHLH啟動子部分的結構示意圖。圖2為bHLH pro轉基因擬南芥及對照野生型擬南芥的根、葉及花器官⑶S染色情況。其中，A為⑶S染色的bHLH pro轉基因擬南芥根；B為⑶S染色的bHLH pro轉基因擬南芥葉；C為GUS染色的bHLH pro轉基因擬南芥花；D為GUS染色的野生型擬南芥根；E為GUS染色的野生型擬南芥葉；F為GUS染色的野生型擬南芥花。具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。擬南芥Columbia-O 生態型:Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC),種子號:CS66730農桿菌GV3101:記載在 “The bHLH Transcription Factor MYC3Interacts withthe Jasmonate ZIM-Domain Proteins to Mediate Jasmonate Response in Arabidopsis。Cheng Zhiweij Sun Li，Qi Tiancongj Zhang Bosenj Peng Wen, Liu Yule,Xie Daoxin.Molecular Plant, 1-10.2010” 一文中，公眾可以從清華大學獲得。pCAMBIA1391Z 載體:此載體可從 Cambia institute 獲得。http://www.cambia.0rg/daisy/cambia/2062.html branch=l&language=l,網址為 pCAMBIA1391Z 載體的圖譜。實施例1、bHLH啟動子序列的獲得以擬南芥Columbia-O生態型的葉片為材料，提取其基因組DNA。以基因組DNA為模板，采用Forward-PstI和Reverse-BamHI組成的引物對,在高保真的PFU酶的作用下進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。Forward-Pst1:5，_aaCTGCAGcatacgatgagctttaagttttggtc_3’(大寫字母部分為Pst I的識別位點，其后的序列為序列I的第1-26位)；Reverse-BamH1:5，-cgcGGATCCcaacaaaaaggaaagacttttaag-3，(大寫字母部分為BamH I的識別位點，其后的序列為序列I的第2479-2502位的反向互補序列)。將PCR擴增所得產物進行測序，測序結果表明PCR產物的序列為“aaCTGCAG+序列I+GGATCCgcg^0將序列表的序列I所示的DNA命名為bHLH啟動子(bHLH pro)。實施例2、轉基因擬南介的犾得和鑒定一、重組表達載體 pCAMBIA1391Z-bHLH pro-GUS 的構建1、用限制性內切 酶Pst I和BamH I雙酶切實施例1得到的PCR擴增產物，得到酶切產物。2、用限制性內切酶Pst I和BamH I雙酶切pCAMBIA1391Z載體，回收約11.3kb的載體骨架。3、將步驟I的酶切產物本文檔來自技高網...

【技術保護點】
DNA分子，為如下1）?3）中任一種：1）序列表中序列1所示的DNA分子；2）在嚴格條件下與1）限定的DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子；3）與1）或2）限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA分子。

【技術特征摘要】
1.DNA分子,為如下1)-3)中任一種: 1)序列表中序列I所不的DNA分子； 2)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子； 3)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA分子。2.含有權利要求1所述DNA分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。3.根據權利要求2所述的重組載體，其特征在于:所述重組載體為在PCAMBIA1391Z載體的多克隆位點處插入權利要求1所述DNA分子后得到的重組質粒。4.根據權利要求2所述的表達盒，其特征在于:所述表達盒由具有啟動子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子啟動表達的目的基因，以及轉錄終止序列組成；所述DNA分子以功能性方式與所述目的基因連接，且所述...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張博森，宋素勝，齊天從，樊萌，田海霞，田翠麗，彭文，謝道昕，
申請(專利權)人：清華大學，
類型：發明
國別省市：