新型腈水合酶制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)的目的為提供一種具有新型突變位點的腈水合酶的氨基酸序列及其基因的堿基序列，另外本發(fā)明專利技術(shù)的目的還在于提供一種對具有腈水合酶活性的酶進行修飾的方法。作為解決目前問題的方法，提供了在來源于嗜熱假諾卡氏菌JCM3095、由2種異源亞單位構(gòu)成的腈水合酶中引入新型突變而得到的突變體的氨基酸序列及其基因的堿基序列。而且，通過確定腈水合酶的立體結(jié)構(gòu)/氨基酸序列中作為修飾對象的區(qū)域，并對與形成所述區(qū)域的氨基酸殘基對應(yīng)的氨基酸序列中的氨基酸進行置換、插入、缺失等改變從而修飾腈水合酶。通過本發(fā)明專利技術(shù)，能夠比現(xiàn)有技術(shù)更高效率地將腈化合物轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的酰胺化合物。（*該技術(shù)在2023年保護過期，可自由使用*）

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種新型腈水合酶及編碼其的基因、含有該基因的質(zhì)粒、經(jīng)該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的細胞株、及用所述細胞株生產(chǎn)腈水合酶的方法、以及利用培養(yǎng)所述細胞株得到的培養(yǎng)液、細胞、細胞處理物從腈化合物制備對應(yīng)的酰胺化合物的方法。另外，本專利技術(shù)還涉及一種改變具有腈水合酶活性的酶的性質(zhì)的方法。此外，本專利技術(shù)還涉及一種改變了性質(zhì)的酶及編碼其的基因、含有所述基因的質(zhì)粒、經(jīng)所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的細胞株、用所述細胞株生產(chǎn)腈水合酶的方法，以及利用培養(yǎng)所述細胞株得到的培養(yǎng)液、細胞、細胞處理物從腈化合物制備對應(yīng)的酰胺化合物的方法。本專利技術(shù)可有效用于利用生物催化劑的物質(zhì)生產(chǎn)領(lǐng)域中。
技術(shù)介紹
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了作為具有腈水合活性的酶的腈水合酶，該酶能夠通過水合作用將各種化合物的腈基轉(zhuǎn)換成酰胺基，并且公開了多種生產(chǎn)該酶的微生物株。為了在工業(yè)上利用腈水合酶從腈化合物制造酰胺化合物，降低該酶的制造成本在酰胺化合物的制造成本中所占的比例尤顯重要。具體而言，必須提高每單位重量酶制備物中該酶的含量。因此為了利用所述酶的基因通過基因工程學(xué)方法大量表達所述酶，嘗試對所述酶的基因進行克隆的方法。作為具有腈水合酶活性的微生物，有紫紅紅球菌J-1株(根據(jù)布達佩斯條約，保藏在茨城縣筑波市東1-1-1號中央第6獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心，保藏編號為 FERMBP-1478)、嗜熱假諾卡氏菌(本菌株保藏在理化學(xué)研究所微生物系統(tǒng)保存處(埼玉縣和光市廣澤2-1)，保藏編號為JCM3095，任何人都可經(jīng)申請獲得；另外，根據(jù)布達佩斯條約，保藏在獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心，保藏編號為FERM BP-73790 )(參照專利文獻I及3)。另外，從上述菌株中分離出了腈水合酶，已經(jīng)確認了該酶一般以稱為α亞單位及β亞單位的2種多肽為構(gòu)成要素。并且，從上述菌株中分離出了腈水合酶基因，確定了其氨基酸序列和堿基序列。進而，制備了可使上述腈水合酶在轉(zhuǎn)化子內(nèi)表達的質(zhì)粒及經(jīng)所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的細胞株(例如，TGl/pNHJ10H及MT-10822:根據(jù)布達佩斯條約，前者保藏在獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心，保藏編號為FERM BP-2777 ;后者于1996年2月7日保藏在茨城縣筑波市東1-1-1號中央第6獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心，保藏編號為FERM BP-5785)。除此之外，能夠經(jīng)上述細胞株生產(chǎn)腈水合酶、以及通過使所述細胞株或者由其制得的腈水合酶與腈化合物接觸以制備對應(yīng)的酰胺化合物(參照專利文獻2、4，非專利文獻I)。另外，也進行了分析腈水合酶的立體結(jié)構(gòu)的嘗試，分析結(jié)果以PDB編號1AHJ、2AHJ、1IRE被公開。已知所述酶的基本結(jié)構(gòu)單位為α亞單位及β亞單位結(jié)合而成的2聚體，該2聚體進一步結(jié)合形成4聚體、8聚體、12聚體(根據(jù)來源的生物種而不同)而發(fā)揮活性。另外，形成活性中心的區(qū)域、結(jié)構(gòu)也已明確，活性中心并非表露于與反應(yīng)溶劑直接接觸的酶外側(cè)的位置，而是包埋于酶的內(nèi)部。也清楚發(fā)揮活性所必須的金屬原子(鈷原子或者鐵原子:根據(jù)來源的生物種而不同)在活性中心的配位形態(tài)，并已知作為伴隨金屬原子配位發(fā)生的現(xiàn)象，形成活性中心區(qū)域的氨基酸序列中半胱氨酸殘基在翻譯后發(fā)生氧化。具體而言，α亞單位的氨基酸序列中序列X1CXLC1SC2X2X3X4X5(其中，C表示半胱氨酸，X表示絲氨酸或蘇氨酸，L表示亮氨酸，C1表示半胱亞磺酸(cysteine sulfinicacid、3_sulfinoalanine), S 表不絲氨酸，C2 表不半胱次橫酸(cysteine sulfenicacid、S-hydroxy-cysteine), X1^ Χ2> Χ3> Χ4> X5表示任意氨基酸)表示的區(qū)域為構(gòu)成金屬原子在活性中心進行配位的區(qū)域(參照非專利文獻2 4)。但是，還沒有任何專利技術(shù)公開關(guān)于在不影響腈水合酶自身活性的情況下，改變其活性、底物特異性、Vmax、Km、熱穩(wěn)定性、底物穩(wěn)定性、產(chǎn)物穩(wěn)定性等性質(zhì)的具體方法。特別是著眼于腈水合酶的立體結(jié)構(gòu)、通過改變結(jié)構(gòu)而改變上述性質(zhì)的方法還未作任何嘗試。另外，專利文獻5中公開了使編碼腈水合酶的基因在宿主細胞中表達而生產(chǎn)具有酶活性的腈水合酶時，存在一種參與激活所述酶的蛋白質(zhì)。專利文獻1:特開平2-470號公報專利文獻2:特開平4-211379號公報專利文獻3:特開平8-56684號公報專利文獻4:特開平9-275978號公報專利文獻5:特開平11-253168號公報非專利文獻 1:Kobayashi M, Nishiyama M, Nagasawa T, Horinouchi S, BeppuΤ，Yamada H.Cloning, nucleotide sequence and expression inEscherichia coli oftwo cobalt-containing nitrile hydratase genes fromRhodococcus rhodochrousJl.Biochim Biophys Acta.1991Dec 2 ；1129 (I):23_33.非專利文獻2:Huang W, Jia J，Cummings J，Nelson M，Schneider G，LindqvistY.Crystal structure of nitrile hydratase reveals a novel iron centrein a novelfold.Structure.1997May 15 ；5 (5):691-9.非專利文獻3:Nagashima SiNakasako MiDohmae N, Tsujimura M, Takio K, OdakaM，Yohda M，Kamiya N，Endo 1.Novel non-heme ironcenter of nitrile hydratase witha claw setting of oxygen atoms.Nat StructBiol.1998May ；5(5):347_5L非專利文獻4:Miyanaga，A.，F(xiàn)ushinobu，S.，Ito，K.，and Wakagi, T.Crystalstructure of cobalt-containing nitrile hydratase.Biochem.Biochem Biophys ResCommun.200INov 16 ；288(5):1169-74.
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一種具有新型置換突變位點但功能無實質(zhì)變化的腈水合酶的氣基酸序列和該基因的減基序列，還提供一種含有所述基因的質(zhì)粒、經(jīng)所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的細胞株、及用所述細胞株生產(chǎn)所述酶的方法，以及利用培養(yǎng)所述細胞株得到的培養(yǎng)液、細胞、細胞處理物從腈化合物制備對應(yīng)的酰胺化合物的方法。本專利技術(shù)的其它目的在于提供一種在不損害腈水合酶自身活性的情況下，改變其活性、底物特異性、Vmax, Km、熱穩(wěn)定性、底物穩(wěn)定性、產(chǎn)物穩(wěn)定性等性質(zhì)中的一種或一種以上的具體方法。具體而言，提供一種通過在腈水合酶基因中引入導(dǎo)致腈水合酶立體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的突變而改變上述性質(zhì)的方法，進而，提供一種經(jīng)修飾方法得到的腈水合酶、編碼所述腈水合酶的基因、含有所本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種腈水合酶突變體，是具有由序列表1的序列號1的氨基酸序列構(gòu)成的α亞單位及由序列表1的序列號2的氨基酸序列構(gòu)成的β亞單位的腈水合酶的至少一個以上的氨基酸置換為其它氨基酸而得到的腈水合酶突變體，其中?所述腈水合酶具有作為底物的腈化合物從腈水合酶外部進入活性中心時、或作為產(chǎn)物的酰胺化合物從活性中心移至腈水合酶外部時所述底物或所述產(chǎn)物通過的孔穴，?所述腈水合酶突變體包含下述突變，所述突變是選自由位于所述孔穴形成的區(qū)域中的、所述序列號1的氨基酸序列的第36及48位的氨基酸及所述序列號2的氨基酸序列的第32、33、37、40、41、46、48、51、61、72、112、118、127位氨基酸構(gòu)成的組中的任一氨基酸置換為下述(i)～(xv)所示的其它氨基酸而得到的突變，?(i)所述序列號1的氨基酸序列的第36位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Met、Ser、Ala、Gly或Trp，?(ii)所述序列號1的氨基酸序列的第48位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Gln或Glu，?(iii)所述序列號2的氨基酸序列的第32位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Gly，?(iv)所述序列號2的氨基酸序列的第33位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Val或Met，?(v)所述序列號2的氨基酸序列的第37位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Thr、Ala、Leu、Ile或Val，?(vi)所述序列號2的氨基酸序列的第40位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Val、Leu或Ile，?(vii)所述序列號2的氨基酸序列的第41位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Glu、Thr、Ala、Leu、Tle或Val，?(viii)所述序列號2的氨基酸序列的第46位氨基酸置換為其它?氨基酸時，置換為Gly、Tyr、Leu、Lys或Asp，?(ix)所述序列號2的氨基酸序列的第48位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Gly、Ala、Val、Ser、Thr或Arg，?(x)所述序列號2的氨基酸序列的第51位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Ala或Val，?(xi)所述序列號2的氨基酸序列的第61位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Val、Leu、Gly、Ser、Thr或Trp，?(xii)所述序列號2的氨基酸序列的第72位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Phe，?(xiii)所述序列號2的氨基酸序列的第112位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Val或Ile，?(xiv)所述序列號2的氨基酸序列的第118位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Ala、Leu、Ile或Val，?(xv)所述序列號2的氨基酸序列的第127位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Ala、Val或Ser。...

【技術(shù)特征摘要】
2002.12.19 JP 368360/2002;2003.11.10 JP 379280/201.一種腈水合酶突變體，是具有由序列表I的序列號I的氨基酸序列構(gòu)成的a亞單位及由序列表I的序列號2的氨基酸序列構(gòu)成的P亞單位的腈水合酶的至少一個以上的氨基酸置換為其它氨基酸而得到的腈水合酶突變體，其中 所述腈水合酶具有作為底物的腈化合物從腈水合酶外部進入活性中心時、或作為產(chǎn)物的酰胺化合物從活性中心移至腈水合酶外部時所述底物或所述產(chǎn)物通過的孔穴， 所述腈水合酶突變體包含下述突變，所述突變是選自由位于所述孔穴形成的區(qū)域中的、所述序列號I的氨基酸序列的第36及48位的氨基酸及所述序列號2的氨基酸序列的第32、33、37、40、41、46、48、51、61、72、112、118、127位氨基酸構(gòu)成的組中的任一氨基酸置換為下述(i) (XV)所示的其它氨基酸而得到的突變， (i)所述序列號I的氨基酸序列的第36位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Met、Ser> Ala、Gly 或 Trp, (ii)所述序列號I的氨基酸序列的第48位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Gln或Glu, (iii)所述序列號2的氨基酸序列的第32位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Gly， (iv)所述序列號2的氨基酸序列的第33位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Val或Met, (V)所述序列號2的氨基酸序列的第37位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Thr、Ala、Leu、Ile 或 Val, (vi)所述序列號2的氨基酸序列的第40位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Val、Leu 或 lie, (vii)所述序列號2的氨基酸序列的第41位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Glu、Thr、Ala、Leu、Tie 或 Val, (viii)所述序列號2的氨基酸序列的第46位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Gly、Tyr> Leu、Lys 或 Asp, (ix)所述序列號2的氨基酸序列的第48位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Gly、Ala、Val、Ser、Thr 或 Arg, (X)所述序列號2的氨基酸序列的第51位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Ala或Val, (xi)所述序列號2的氨基酸序列的第61位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Val、Leu、Gly、Ser> Thr 或 Trp, (xii)所述序列號2的氨基酸序列的第72位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Phe， (xiii)所述序列號2的氨基酸序列的第112位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Val 或 lie, (xiv)所述序列號2的氨基酸序列的第118位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Ala、Leu、Ile 或 Val, (XV)所述序列號2的氨基酸序列的第127位氨基酸置換為其它氨基酸時，置換為Ala、Val 或 Ser02.如權(quán)利要求1所述的腈水合酶突變體，其特征在于， 當包含所述⑴的突變時，所述序列號I的氨基酸序列第36位氨基酸置換為Met的所述α亞單位進一步包含在第148位和第204位氨基酸處分別成為Asp和Arg的置換， 當包含所述(XV)的突變時，所述序列號2的氨基酸序列第127位氨基酸置換為Ser的所述β亞單位進一步包含在第160位和第186位氨基酸處分別成為Trp和Arg的置換。3.如權(quán)利要求1所述的腈水合酶突變體，其特征在于， 當包含所述⑴的突變時，所述序列號I的氨基酸序列第36位氨基酸置換為Met的所述α亞單位進一步包含在第126位氨基酸處成為Tyr的置換， 當包含所述⑴的突變時，所述序列號I的氨基酸序列第36位氨基酸置換為Met的所述α亞單位進一步包含在第6位和第126位氨基酸處分別成為Thr和Tyr的置換。4.如權(quán)利要求1所述的腈水合酶突變體，其特征在于， 當包含所述(i)及(xiv)的突變時，所述突變體具有:包含在所述序列號I的氨基酸序列第6、36及126位氨基酸處分別成為Thr、Met和Tyr的置換的所述α亞單位，和包含在所述序列號2的氨基酸序列第10、118及200位氨基酸處分別成為Asp、Val和Glu的置換的所述β亞單位，或者 當包含所述(i)、(vii)及(X)的突變時，所述突變體具有:包含在所述序列號I的氨基酸序列第36、148及204位氨基酸處分別成為Met、Asp和Arg的置換的所述α亞單位，且包含在所述β亞單位的序列號2的氨基酸序列第41、51及108位氨基酸處分別成為He、Val和Asp的置換的所述β亞單位。5.如權(quán)利要求1所述的腈水合酶突變體，其特征在于， 當包含所述(X)的突 變時，所述序列號2的氨基酸序列第51位氨基酸置換為Val的所述β亞單位進一步包含在第108位氨基酸處成為Asp的置換,或者 當包含所述(xiv)的突變時，所述序列號2的氨基酸序列第118位氨基酸置換為Val的所述β亞單位進一步包含在第200位氨基酸處成為Glu的置換，或者 當包含所述(xiv)的突變時，所述序列號2的氨基酸序列第118位氨基酸置換為Val的所述β亞單位進一步包含在第10和200位氨基酸處分別成為Asp和Glu的置換，或者當包含所述(V)的突變時，所述序列號2的氨基酸序列第37位氨基酸置換為Leu的所述β亞單位進一步包含在第108和200位氨基酸處分別成為Asp和Glu的置換，或者當包含所述(V)的突變時，所述序列號2的氨基酸序列第37位氨基酸置換為Val的所述β亞單位進一步包含在第108和200位氨基酸處分別成為Asp和Glu的置換，或者當包含所述(vii)和所述(X)的突變時，所述序列號2的氨基酸序列第41氨基酸置換為Ile的所述β亞單位進一步包含在第51和108位氨基酸處分別成為Val和Asp的置換，或者 當包含所述(viii)的突變時，所述序列號2的氨基酸序列第46氨基酸置換為Lys的所述β亞單位進一步包含在第108和212位氨基酸處分別成為Arg和Tyr的置換,或者當包含所述(ix)的突變時，所述序列號2的氨基酸序列第48氨基酸置換為Val的所述β亞單位進一步包含在第108和212位氨基酸處分別成為Arg和Tyr的置換。6.如權(quán)利要求1所述的腈水合酶突變體， 當包含所述(viii)的突變時，包含在所述α亞單位的所述序列號I的氨基酸序列第6、19和126位氨基酸處分別成為Thr、Val和Tyr的置換，且包含在所述β亞單位的所述序列號2的氨基酸序列第46、108和212位氨基酸處分別成為Lys、Arg和Tyr的置換，或者當包含所述(ix)的突變時，包含在所述α亞單位的所述序列號I的氨基酸序列第6、19和126位氨基酸處分別成為Thr、Val和Tyr的置換，且包含在所述β亞單位的所述序列號2的氨基酸序列第48、108和212位氨基酸處分別成為Val、Arg和Tyr的置換，或者當包含所述(V)的突變時，包含在所述α亞單位的所述序列號I的氨基酸序列第19、71和126位氨基酸處分別成為Val、His和Tyr的置換，且包含在所述β亞單位的所述序列號2的氨基酸序列第37、108和200位氨基酸處分別成為LeiuAsp和Glu的置換，或者當包含所述(V)的突變時，包含在所述α亞單位的所述序列號I的氨基酸序列第19、71和126位氨基酸處分別成為Val、His和Tyr的置換，且包含在所述β亞單位的所述序列號2的氨基酸序列第37、108和200位氨基酸處分別成為Val、Asp和Glu的置換，或者當包含所述(XV)的突變時，包含在所述α亞單位的所述序列號I的氨基酸序列第6、19和126位氨基酸處分別成為Ala、Val和Tyr的置換，且包含在所述β亞單位的所述序列號2的氨基酸序列第127、160和186位氨基酸處分別成為Ser、Trp和Arg的置換。7.一種編碼腈水合酶的基因，具有編碼腈水合酶的α亞單位的氨基酸序列的基因與編碼腈水合酶的β亞單位的氨基酸序列的基因，其特征在于，編碼如權(quán)利要求1或2所述的腈水合酶突變體。8.如權(quán)利要求7所述的基因，其特征在于， 編碼所述α亞單位的氨基酸序列的基因具有包含下述置換的堿基序列: 序列表的序列號3的喊基序列中弟106至108似喊基處成為ATG、TCG、GCG、GGG或TGG的置換，或 第142至144位成為CAA或GAA的置換， 或 編碼所述β亞單位的氨基酸 序列的基因具有包含下述置換的堿基序列: 序列表的序列號...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：八卷俊文，番場伸一，的石香，伊藤潔，小林英樹，田中英司，及川利洋，
申請(專利權(quán))人：三井化學(xué)株式會社，
類型：發(fā)明
國別省市：