本發(fā)明專利技術(shù)為一種球化酶技術(shù)固定化腈水合酶的方法，該方法包括以下步驟：（1）向腈水合酶溶液中加入保護劑PLL，混合均勻作為水相；另向正己烷中加入表面活性劑span-80，混合均勻作為油相；再把水相和油相混合攪拌制成粗乳液；（2）?將上步得到的粗乳液在5~?30kpa的跨膜壓力下通過SPG膜乳化器，待粗乳液完全通過SPG膜后，即得到W/O型（油包水）乳液，然后向該乳液中滴加交聯(lián)劑戊二醛，在4oC下交聯(lián)0.5～4h，離心洗滌，即可得到球形腈水合酶粒子。本發(fā)明專利技術(shù)的制備工藝簡單，條件溫和，酶活回收率在50%以上。重復(fù)使用10次后，酶活還可達到初始酶活的45%左右。同游離酶相比，儲藏穩(wěn)定性也更好。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于固定化酶領(lǐng)域，特別是一種球化酶技術(shù)固定化腈水合酶的方法。
技術(shù)介紹
與傳統(tǒng)的化學催化相比，酶催化具有溫和的轉(zhuǎn)化條件、高的反應(yīng)速率、優(yōu)異的選擇性等優(yōu)點，催化過程具有能耗低、物耗少、環(huán)境友好等優(yōu)點。在大力倡導(dǎo)流程工業(yè)綠色化、節(jié)能減排的新形勢下，酶催化將在大宗化學品、精細化學品的工藝取代以及環(huán)境化學等方面發(fā)揮日益重要的作用。但由于以下方面的約束，限制了酶催化更廣泛的應(yīng)用：(1)脫離了細胞內(nèi)的微環(huán)境，酶在細胞外對溫度和pH耐受范圍窄、適應(yīng)性差、易失活等；(2)酶提取純化的費用較高，而在應(yīng)用過程中重復(fù)利用率低、操作穩(wěn)定性差、造成酶催化成本較高；(3)對非天然底物的催化活性低。因此，如何最大限度地提高酶在胞外環(huán)境中的活性和穩(wěn)定性、使其更有效的適應(yīng)非生理催化環(huán)境、實現(xiàn)高效催化是新一代工業(yè)生物催化技術(shù)發(fā)展的重要課題。其中采用新穎的固定化酶技術(shù)、改造和發(fā)展高效固定化酶催化劑是解決以上問題的重要途徑。球化酶(Spherezyme)技術(shù)是一種無載體固定化酶技術(shù)。首先將含有酶的水相分散在含有活性劑的油相當中進行，形成了油包水的乳液，這個過程稱為乳化；然后加入交聯(lián)劑，使得蛋白分子之間通過交聯(lián)劑連接穩(wěn)定成球，經(jīng)過交聯(lián)的過程得到球化酶，如圖1所示。由于這種技術(shù)是在交聯(lián)酶聚集體技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來，在具備交聯(lián)酶聚集體技術(shù)的所有優(yōu)勢的同時，也在一定程度上克服了其粒徑不可控，機械強度差等缺點，具有較高的比酶活。球化酶在水油兩相中形成，可以在一定程度上影響酶的方向，有利于酶在兩相界面上定位。球化酶技術(shù)形成的是粒徑可控的球狀結(jié)構(gòu)，有利于固定化酶在反應(yīng)體系中的分散，且球狀結(jié)構(gòu)擁有較大的比表面積更利于固定化酶與底物接觸反應(yīng)。同時，球化酶的制備過程簡單，成本低廉。Brady等采用的球化酶技術(shù)，是將乳化法與交聯(lián)酶聚集體技術(shù)結(jié)合制備出0.5-10μm的脂肪酶微球，此微球可進一步團聚形成100μm左右的團聚體，在一定程度上實現(xiàn)了無載體固定化酶的可控制備，但由于該方法采用的是傳統(tǒng)的乳化技術(shù)，乳液液滴和固定化酶微球可控制備性差。因此本專利技術(shù)采用新的乳化方法---膜乳化技術(shù)，以此為基礎(chǔ)，利用球化酶技術(shù)對腈水合酶進行固定化。腈水合酶(Nitrilehydratase，EC4.2.1.84)是一種可以將腈類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為酰胺類物質(zhì)的酶，例如：在全細胞或者游離的腈水合酶的催化作用下，丙烯腈可以轉(zhuǎn)化為丙烯酰胺；3-腈基吡啶可以轉(zhuǎn)化為煙酰胺。酰胺類物質(zhì)在有機合成、醫(yī)藥、農(nóng)藥等方面有著十分重要的應(yīng)用。同全細胞相比，游離的腈水合酶更受青睞，因為它具有嚴格的化學、區(qū)域和對映選擇性及底物專一性。但是，游離酶的使用通常會因為價格昂貴，溫度、pH和操作穩(wěn)定性低，難以回收利用等因素受到限制。將游離酶進行固定化可以在一定程度上提高酶的耐受性，并且能夠循環(huán)使用，方便下游過程的操作。目前報道的腈水合酶固定化技術(shù)主要包括交聯(lián)酶聚集體技術(shù)、溶膠-凝膠包埋技術(shù)等。同交聯(lián)酶聚集體技術(shù)相比，球化酶可控性更強，分散性更好；同有載體固定化酶方法相比，球化酶技術(shù)成本低廉。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是針對當前技術(shù)的不足，提供一種操作簡單、成本低廉的固定化腈水合酶的方法。該方法以膜乳化為基礎(chǔ)，采用球化酶技術(shù)對腈水合酶進行固定化。膜乳化是在一定的壓力下，將分散相通過微孔膜分散到連續(xù)相中，由膜孔徑來控制而呈單分散性，和傳統(tǒng)乳化方法相比，具有能耗低、制備條件溫和、粒徑大小及分布可控、制備的乳液穩(wěn)定性和重復(fù)性好等優(yōu)點。另外，膜乳化的設(shè)備工藝簡單易行，易于規(guī)模化，因而近年來被廣泛關(guān)注。對于球化酶而言，粒徑均一、粒度可控是保證其得到很好應(yīng)用的前提。該方法固定化酶制備工藝簡單，酶活損失小，且固定化效率較高。本專利技術(shù)的技術(shù)方案是：一種球化酶技術(shù)固定化腈水合酶的方法，包括以下步驟：(1)向腈水合酶溶液中加入保護劑PLL，混合均勻作為水相；另向正己烷中加入表面活性劑span-80，混合均勻作為油相；再把水相和油相混合攪拌制成粗乳液；其中，腈水合酶溶液的濃度為0.1～0.5g/mL，PLL的質(zhì)量為腈水合酶溶液質(zhì)量的1％～3％；span-80的質(zhì)量為正己烷質(zhì)量的1％～5％；體積比為水相：油相＝1：3～9；(2)將上步得到的粗乳液在5～30kpa的跨膜壓力下通過SPG膜乳化器，待粗乳液完全通過SPG膜后，即得到W/O型(油包水)乳液，然后向該乳液中滴加交聯(lián)劑戊二醛，在4℃下交聯(lián)0.5～4h，離心洗滌，即可得到球形腈水合酶粒子；其中，體積比戊二醛：W/O型乳液＝1：60～90。本專利技術(shù)的有益效果是：1.本專利技術(shù)針對傳統(tǒng)乳化法制備球化酶可控制備性差的缺點，將膜乳化技術(shù)應(yīng)用到球化酶的制備過程中，實現(xiàn)粒徑均一的球化酶的可控制備。球形腈水合酶粒徑分布在8-20μm的范圍內(nèi)，呈現(xiàn)規(guī)則球狀結(jié)構(gòu)，分散性也比較好，如圖3所示。2.本專利技術(shù)的制備工藝簡單，條件溫和，酶活回收率在50％以上。重復(fù)使用10次后，酶活還可達到初始酶活的45％左右。同游離酶相比，儲藏穩(wěn)定性也更好。附圖說明圖1為球化酶的制備過程示意圖。圖2為膜乳化法制備球形腈水合酶的示意圖。圖3為實施例2中球形腈水合酶的掃描電鏡圖。具體實施方式本專利技術(shù)所述的球化酶的制備過程如圖1所示：首先將含有酶的水相分散在含有活性劑的油相當中進行，形成了油包水的乳液，這個過程稱為乳化；然后加入交聯(lián)劑，使得蛋白分子之間通過交聯(lián)劑連接穩(wěn)定成球，經(jīng)過交聯(lián)的過程得到球化酶。具體實驗中的膜乳化法制備球形腈水合酶的示意圖則如圖2所示。配制一定濃度的腈水合酶溶液，加入適量的保護劑和表面活性劑，取一定量的上述溶液加入到適量的油相中，機械攪拌，制備乳化液；將制備的乳化液在一定的跨膜壓力下通過SPG膜乳化器，得到粒徑均一的W/O型乳液；向此乳液中加入一定量的交聯(lián)劑，攪拌一定時間，靜置；離心分離，洗滌，最終得到球形腈水合酶。本專利技術(shù)所使用的腈水合酶ES-NHT-118(初始酶活為5U/mg左右)，購買自浙江寶賽生物科技有限公司。本專利技術(shù)所使用的PLL(多聚賴氨酸)、正己烷、span-80、戊二醛均購買自天津金海華興科技發(fā)展有限公司。本專利技術(shù)使用的SPG玻璃膜以及SPG膜乳化裝置購買自日本SPGTechnology公司。實施例1：1向腈水合酶溶液中加入保護劑PLL，混合均勻作為水相；另向正己烷中加入表面活性劑span-80，混合均勻作為油相；再把水相和油相混合攪拌制成粗乳液；其中，腈水合酶溶液的濃度為0.2g/mL，PLL的質(zhì)量為腈水合酶溶液質(zhì)量的1％；span-80的質(zhì)量為正己烷質(zhì)本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種球化酶技術(shù)固定化腈水合酶的方法，其特征為包括以下步驟：（1）?向腈水合酶溶液中加入保護劑PLL，混合均勻作為水相；另向正己烷中加入表面活性劑span?80，混合均勻作為油相；再把水相和油相混合攪拌制成粗乳液；其中，腈水合酶溶液的濃度為0.1~?0.5?g/mL，PLL的質(zhì)量為腈水合酶溶液質(zhì)量的1%?~?3%；?span?80的質(zhì)量為正己烷質(zhì)量的1%?~?5%；體積比為水相：油相＝1：3～9；（2）?將上步得到的粗乳液在5?~?30?kpa的跨膜壓力下通過SPG膜乳化器，待粗乳液完全通過SPG膜后，即得到W/O型（油包水）乳液，然后向該乳液中滴加交聯(lián)劑戊二醛，在4?oC下交聯(lián)0.5～4?h，離心洗滌，即可得到球形腈水合酶粒子；其中，體積比戊二醛：W/O型乳液＝1：60～90。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種球化酶技術(shù)固定化腈水合酶的方法，其特征為包括以下步驟：
（1）向腈水合酶溶液中加入保護劑PLL，混合均勻作為水相；另向正己烷中加入表面活性劑span-80，混合均勻作為油相；再把水相和油相混合攪拌制成粗乳液；
其中，腈水合酶溶液的濃度為0.1~0.5g/mL，PLL的質(zhì)量為腈水合酶溶液質(zhì)量的1%~3%；span-80的質(zhì)量為正己烷質(zhì)量...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：高靜，姜艷軍，牟海霞，賀瑩，
申請(專利權(quán))人：河北工業(yè)大學，
類型：發(fā)明
國別省市：天津;12
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