本發明專利技術公開了一種結核亞單位疫苗復合佐劑，所述復合佐劑包含有陽離子脂質體二甲基三十六烷基銨DDA、TLR9配體CpG寡脫氧核苷酸2395和TLR3配體PolyICLC，并提供了以其制備的結核亞單位疫苗及制備方法和應用。本發明專利技術的有益效果為：本發明專利技術提供的結核亞單位疫苗復合佐劑，增強了結核分枝桿菌融合蛋白的免疫原性，有助于結核融合蛋白誘導Th1型抗結核免疫應答。
Compound adjuvant of tuberculosis subunit vaccine, subunit vaccine constructed by the same, preparation method and application thereof
The invention discloses a tuberculosis subunit vaccine compound adjuvant, the adjuvant compound containing cationic liposome two methyl thirty-six alkyl ammonium DDA, TLR9 ligand CpG oligodeoxynucleotides 2395 and TLR3 ligand PolyICLC, and provides the preparation method and the application in the preparation of the tuberculosis vaccine and subunit. The invention has the advantages that the invention provides a tuberculosis subunit vaccine compound adjuvant, enhances the immunogenicity of Mycobacterium tuberculosis fusion protein, help tuberculosis anti tuberculosis immune response induced by Th1 fusion protein.
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物制劑領域，具體涉及一種結核亞單位疫苗復合佐劑、以其構建的結核亞單位疫苗及制備方法和應用。
技術介紹
預防性結核疫苗一卡介苗(Bacille Calmette Gu6rin,BCG)對成人的保護力不穩定，因此研制新型的結核疫苗迫在眉睫，尤其是成本低廉，安全性高、不受環境分枝桿菌影響的蛋白疫苗引起人們廣泛關注。但是蛋白疫苗自身免疫原性較減毒疫苗弱，所以必須選擇合適的佐劑以增強疫苗的免疫效果。70多年來，鋁佐劑作為唯一一個注冊佐劑在世界范圍廣泛應用。另外一種佐劑，MF59在一些國家作為預防流感和甲肝疫苗的佐劑，已經注冊。但是，以上兩種佐劑主要介導體液免疫，對于以細胞免疫為主的結核病卻效果不佳。近幾年來，隨著佐劑技術的發展，一系列能誘導較強細胞免疫的佐劑應運而生。如Ag85B-TB10.4、Ag85B_ESAT_6和Mtb72F融合蛋白分別在一種陽離子多肽KLKL5KLK與寡脫氧核苷構成的佐劑(IC31)和由單磷酰脂質A和皂角苷QS-21構成的水-油乳濁液(AS02A)介導下，可誘導有效的免疫保護。一些新技術的應用，如納米技術的進步，也推動了佐劑的發展，如以聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly (lactic-co-glycolic acid), PLGA)為載體的佐劑聯合融合蛋白 TB10.4_Ag85B,能增強T細胞免疫反應。由陽離子脂質體二甲基三十六烷基銨(DDA)和trehalose6, 6-dibehenate (TDB)構成了一種新型的復合佐劑CAF01,并已經用于結核融合蛋白Ag85B-ESAT-6。動物實驗顯示保護效果較理想，已進入臨床一期。從以上各個復合佐劑不難看出佐劑發展的一個趨勢，即單個成分的佐劑可能將被幾種成分的聯合佐劑所取代，因單個佐劑的免疫效應有限，不同的佐劑之間又各有特點，所以合理搭配不同的佐劑，已成為研發新型佐劑的趨勢。已證實MH在陽離子脂質體二甲基三十六燒基銨(dimo-thylidioctylammonium bromide, DDA)與海藻糖二霉菌酸脂(Trehalose 6, 6-dimycolate, TDM)復合佐劑的輔助下具有較強的免疫原性和較高的保護效率，但TDM售價比較昂貴，難以大量推廣。近期研究表明佐劑增強T、B細胞應答，不是直接作用于其本身，而是通過固有免疫的某些成分介導來實現。模式識別受體(PRRs)是固有免疫中免疫受體的代表，由有限數量的胚系基因編碼，進化上十分保守，不受體細胞突變的影響，對生物體的生存十分重要，因此PRRs是佐劑靶位的理想選擇。Toll樣受體(TLR)是識別病原體相關分子模式(PAMP)最為重要的PRRs之一，在人類中已經發現11中，各自識別PAMP中的不同成分和分子
技術實現思路
本專利技術的目的就是針對上述現有技術中的缺陷，提供了一種以DDA為基礎，加入TLR9配體CpG寡脫氧核苷酸2395、TLR3配體PolyICLC組合制備的安全又能輔助誘導細胞免疫反應的蛋白質亞單位疫苗佐劑。為了實現上述目的，本專利技術提供的技術方案為:一種結核亞單位疫苗復合佐劑，所述復合佐劑包含有陽離子脂質體二甲基三十六烷基銨DDA、TLR9配體CpG寡脫氧核苷酸2395 和 TLR3 配體 PolylCLC。進一步的，上述的一種結核亞單位疫苗復合佐劑，所述復合佐劑中，陽離子脂質體二甲基三十六烷基銨DDA、TLR9配體CpG寡脫氧核苷酸2395和TLR3配體PolyICLC的重量比為 10:1:lo本專利技術的第二個目的是提供了上述一種結核亞單位疫苗復合佐劑的制備方法，包括以下步驟: 1)將陽離子脂質體二甲基三十六烷基銨DDA用PBS緩沖液配置為2.5mg/ml濃度，置于80°C水浴IOmin后冷卻至室溫，得到DDA組分溶液； 2)TLR3配體PolylCLC由Poly1:C、多聚左旋賴氨酸和羧甲基纖維素復合而成，配制比按重量計為4:3:10 ； 3)將TLR9配體CpG寡脫氧核苷酸2395和步驟2)得到的TLR3配體PolyICLC以PBS緩沖液分別溶解至lmg/ml，再加入步驟I)得到的DDA組分溶液，制得結核亞單位疫苗復合佐劑。本專利技術的第三個目的是提供了上述一種結核亞單位疫苗復合佐劑在制備結核亞單位疫苗中的應用。進一步的，上述的一種結核亞單位疫苗復合佐劑在制備結核亞單位疫苗中的應用，所述應用是將結核桿菌融合蛋白Mtbl0.4-HspX經PBS稀釋至0.4mg/ml后加入權利要求I或2所述的結核亞單位疫苗復合佐劑，并充分乳化制備得到結核亞單位疫苗。本專利技術的第四個目的是提供了一種結核亞單位疫苗，所述結核亞單位疫苗是由結核桿菌融合細胞和如權利要求1或2所述的結核亞單位疫苗復合佐劑混合構建的。進一步的，上述的一種結核亞單位疫苗，所述結核亞單位疫苗中的結核融合細胞為結核桿菌融合蛋白Mtbl0.4-HspX。本專利技術的第五個目的是提供了一種結核亞單位疫苗的制備方法，是將結核桿菌融合蛋白Mtbl0.4-HspX經PBS稀釋至0.4mg/ml后加入權利要求1或2所述的結核亞單位疫苗復合佐劑，并充分乳化得到的。本專利技術的第六個目的是提供了一種結核亞單位疫苗在結核病防治中的應用。本專利技術的有益效果為:本專利技術提供的結核亞單位疫苗復合佐劑，增強了結核分枝桿菌融合蛋白的免疫原性，有助于結核融合蛋白誘導Thl型抗結核免疫應答，其三個成分主要特性如下: 1.CpG-ODN:含有未甲基化CpG基序的寡脫氧核苷酸(CpG)經內吞作用進入細胞，與細胞漿中的TLR9相互作用，刺激機體的免疫系統，激活多種免疫細胞，產生多種細胞因子，具有誘導激活固有免疫應答和適應性免疫應答的能力，作為佐劑能誘導強烈的Thl型免疫應答，增加細胞毒T淋巴細胞(CTL)的活性，被用作疫苗佐劑和免疫治療劑； 2.PolylCLC: PolyIC是一種合成的雙鏈RNA，與TLR3特異結合，能夠激活固有免疫應答，刺激適應性免疫應答向細胞免疫方向發展，PolyICLC由PolylC、聚左旋賴氨酸和羧甲基纖維素復合而成，具有促進細胞應答 的活性，在體內可延長佐劑效應； 3.DDA=DDA是一種陽離子脂質體，通過儲存抗原延緩其釋放，誘導持續的免疫反應，DDA亦可減少DNA及RNA的胞外降解，有利于核酸進入內含體區室，與其位于內含體區室的TLR結合，從而激活固有免疫。附圖說明圖1為疫苗免疫小鼠抗體水平檢測(以吸光度值計)。其中，A、B、C:抗原MH蛋白包被；D、E、F:抗原HspX蛋白包被，采用ELISA方法檢測血清抗MH和HspX的IgGl、IgG2b、IgG2c抗體水平，抗原包被濃度分別為:MH 5 μ g/ml、HspX 5 μ g/mlο圖2為疫苗免疫小鼠脾淋巴細胞IFN- Y分泌水平(n=4)。其中，A:抗原MH刺激免疫小鼠脾臟淋巴細胞；B:抗原HspX刺激免疫小鼠脾臟淋巴細胞，ΜΗ+CpG+PolyICLC+DDA組分泌IFN-Y的小鼠脾淋巴細胞數最高，>〈0.05 ；MH+CpG+DDA組 及ΜΗ+PolyICLC+DDA組分泌IFN- Y的細胞數分別高于MH+CpG組及MH+PolyICLC, *P〈0.05 ；MH+CpG+PolyICLC 組分泌 IFN- Y 的細胞數高于 MH+Cp本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種結核亞單位疫苗復合佐劑，其特征在于，所述復合佐劑包含有陽離子脂質體二甲基三十六烷基銨DDA、TLR9配體CpG寡脫氧核苷酸2395和TLR3配體PolyICLC。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：李青，祝秉東，劉寶元，牛紅霞，蘇娟，唐克峰，
申請(專利權)人：蘭州大學，
類型：發明
國別省市：
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