本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種蛋白質(zhì)及其在制備抗微生物產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)提供的多肽，如序列表的序列1所示、序列表的序列2所示、序列表的序列3所示或序列表的序列4所示。本發(fā)明專利技術(shù)還保護(hù)具有所述多肽的蛋白質(zhì)、所述多肽的衍生物或含有所述多肽的組合物。本發(fā)明專利技術(shù)對(duì)于微生物，特別是有害微生物的防治，微生物流行病的防治具有重大價(jià)值。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種蛋白質(zhì)及其在制備抗微生物產(chǎn)品中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
與簡(jiǎn)單的無機(jī)分子或是由微生物產(chǎn)生的抗生素類不同，抗菌肽是由基因編碼的，因而高等生物可以根據(jù)其表面的微生物對(duì)這些肽類抗生素的敏感性的變化來靈活調(diào)節(jié)其自身的分子結(jié)構(gòu)，有廣譜、高效的殺菌活性。目前抗菌肽的潛在應(yīng)用價(jià)值受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。迄今發(fā)現(xiàn)的抗菌肽中，主要是小分子抗微生物肽(一般小于100個(gè)氨基酸)，這些內(nèi)源性的短肽分子能夠破壞微生物細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)或功能。在過去的20年里，在植物以及軟體動(dòng)物和人等一系列多細(xì)胞動(dòng)物的細(xì)胞和體液中發(fā)現(xiàn)了數(shù)百個(gè)這類抗微生物肽。大體上，可以粗略地將這些短肽分類為Cecropin樣抗菌肽、富含脯氨酸殘基的抗菌肽、含甘氨酸殘基的抗菌肽和富含半胱氨酸殘基的抗菌肽，其中富含半胱氨酸殘基的堿性抗菌肽被命名為防御素(defensin)。防御素具有廣譜及強(qiáng)力的抗微生物(細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲等)特性，是人粘膜、皮膚以及上皮細(xì)胞的重要免疫作用分子。人防御素包括α、β和Θ三個(gè)家族，分子大小為29-45個(gè)氨基酸，含有六個(gè)半胱氨酸殘基，從而形成三對(duì)二硫鍵。其中，防御素家族在人基因組上約有40個(gè)成員，人β-防御素I (hBD-Ι)于1995年被發(fā)現(xiàn)，隨后在2000年左右hBD-2、hBD-3和hBD-4也相繼被發(fā)現(xiàn)。防御素具有廣譜的抗微生物活性。在體外，防御素在毫摩爾濃度下對(duì)革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰 性菌均具有殺滅作用。其中，微克級(jí)水平的hBD-3對(duì)金黃色葡萄球菌和釀膿鏈球菌等革蘭氏陽性致病菌，綠膿桿菌和大腸桿菌等革蘭氏陰性菌，以及酵母，都具有強(qiáng)烈的殺傷作用，并且對(duì)多重抗藥性的金黃色葡萄球菌和抗萬古霉素的糞腸球菌也可在較低濃度下發(fā)揮殺傷作用。hBD-4可以抑制革蘭氏陽性菌(如葡萄球菌)和革蘭陰性菌(如大腸埃希菌)的生長(zhǎng)，同時(shí)抗綠膿桿菌的活性也很強(qiáng)。此外，β -防御素對(duì)病毒、真菌(如酵母等)等微生物也有抑制作用。β -防御素的直接殺菌作用是由于β -防御素分子呈陽性、帶正電荷，能夠與帶負(fù)電荷、呈陰性的細(xì)菌表面結(jié)合，結(jié)合后其分子中的疏水區(qū)可插入到細(xì)菌的胞膜，而其帶電區(qū)(帶正點(diǎn)荷)則與細(xì)菌胞膜上帶負(fù)電荷的磷脂頭部和水分子相互作用。在細(xì)胞膜上多個(gè)β -防御素分子聚集形成孔隙或通道，使得正常情況下處于胞外的離子、多肽等流入胞內(nèi)，而胞內(nèi)重要的鹽類、大分子等則泄漏到胞外，最終導(dǎo)致不可逆性的菌體死亡。β -防御素在細(xì)胞膜上的通道形成過程與膜的磷脂組成成分和所處的溫度環(huán)境等因素有關(guān)。然而，一旦β -防御素在膜上形成了通道，上述因素便不會(huì)對(duì)其通道的活動(dòng)構(gòu)成本質(zhì)的影響。防御素的表達(dá)水平和活力受作用環(huán)境的鹽濃度和離子種類的影響。過高的鹽濃度(如IOOmM以上PBS緩沖液)會(huì)導(dǎo)致防御素活性水平急劇下降。一價(jià)離子對(duì)防御素活性影響較小，二價(jià)離子(如鈣、鎂離子)則可顯著降低防御素的活性。分析認(rèn)為較高的鹽濃度(>50mM)可能會(huì)影響防御素的帶電量，進(jìn)而降低其抗菌效果，而人體生理環(huán)境鹽濃度約為150mM，一定程度限制了防御素的臨床應(yīng)用。因此，提升防御素的活性和耐鹽能力可推動(dòng)防御素的實(shí)際應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種蛋白質(zhì)及其在制備抗微生物產(chǎn)品中的應(yīng)用。本專利技術(shù)提供的多肽，如序列表的序列I所示、序列表的序列2所示、序列表的序列3所示或序列表的序列4所示。本專利技術(shù)還保護(hù)具有所述多肽的蛋白質(zhì)(包括將所述多肽進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的蛋白質(zhì)，也包括將所述多肽與其他標(biāo)簽蛋白或功能蛋白進(jìn)行融合得到的融合蛋白)、所述多肽的衍生物或含有所述多肽的組合物。本專利技術(shù)還保護(hù)所述多肽、所述蛋白質(zhì)、所述衍生物或所述組合物在制備抑制微生物生長(zhǎng)和/或殺滅微生物的產(chǎn)品中的應(yīng)用。本專利技術(shù)還保護(hù)一種抑制微生物生長(zhǎng)和/或殺滅微生物的產(chǎn)品，其活性成分為所述多肽、所述蛋白質(zhì)、所述衍生物或所述組合物。本專利技術(shù)提供的產(chǎn)品，除了所述有效成分外，可以添加藥學(xué)上允許的稀釋劑、賦形齊 、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤(rùn)滑劑、增效劑、添加劑等。本專利技術(shù)提供的產(chǎn)品，可為片劑、散劑、顆粒劑、液劑、乳劑或懸濁劑等，亦可為粉劑、水劑、油劑、軟膏、硬膏、噴霧劑等。本專利技術(shù)還保護(hù)所述多肽、所述蛋白質(zhì)、所述衍生物或所述組合物在抑制微生物生長(zhǎng)和/或殺滅微生物中的應(yīng)用。以上任一所述的微生物可為細(xì)菌，具體可為革蘭氏陽性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌，更具體可為大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、福氏志賀菌、宋氏志賀菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌或表皮葡萄球菌。本專利技術(shù)通過改變現(xiàn)有防御素的氨基酸組成和部分序列，設(shè)計(jì)新的抗菌肽，通過影響多肽或其部分區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)、帶電荷量、疏水性等特性，從而保持或提高其抗微生物活性，并具有更好的耐鹽能力。本專利技術(shù)對(duì)于微生物，特別是有害微生物的防治，微生物流行病的防治具有重大價(jià)值。具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本專利技術(shù)，但并不限定本專利技術(shù)。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。PBS緩沖液的制備方法:將8mmol Na2HPO4和2moI NaH2PO4溶于水并用水定容至IL0LB培養(yǎng)基的制備方法:取胰化蛋白胨(0X0ID，批號(hào)804054) 10g、酵母提取物(0X0ID,批號(hào)1173143)5g、NaCl (西隴化工股份有限公司，批號(hào)1207032) 10g，用蒸餾水定容至 1L，pH7.4。MH培養(yǎng)基(水解酪蛋白培養(yǎng)基):青島海博生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20121105。實(shí)施例1、抗菌肽的設(shè)計(jì)已報(bào)道的β -防御素3 (hBD-3)和β -防御素4 (hBD-4)的序列如下:β防御素3、4的氨基酸序列為:hBD-3:GI INTLQKYYCRVRGGRCAVLSC !LPKHHQI(；k| CSTRGRKCCRRKKhBD-4:EFELDRICGYGTARCRKKC jRSQEYR IGR CPNTYACCLRKffDESLLNRTKP根據(jù)已報(bào)道的β -防御素3和β -防御素4，設(shè)計(jì)新的抗菌肽如下:Η4 (序列表的序列 2):GIINTLQKYYCRVRGGRCAVLSC bSQR￥Rlfiw| CSTRGRKCCRRKK。H4中，用hBD-4中的方框部分取代了 hBD_3中的方框部分。3N4I (序列表的序列 I):QKYYCRVRGGRCAVLSCRSQEYRIGRCSTRGRKCCRRKK。3N4I中，刪除了 H4中的下劃線部分。MIX-M (序列表 的序列 3):GIIAVLAKWCRVRKKRCAVLSCPRRAKRIGKCSTRGRKCCRRKK。MIX-M中，對(duì)H4中的若干氨基酸殘基進(jìn)行了突變，見粗體字母。HBD3-M (序列表的序列 4):GIINTLQKYYCRVRGGRCAVLSCLPKEESISKCSTRGRKCCRRKK。HBD3-M中，對(duì)H4中的若干氨基酸殘基進(jìn)行了突變，見粗體字母。實(shí)施例2、抗菌肽的合成委托上海波泰生物技術(shù)有限公司，采用9-芴甲氧羰基法(Fmoc固相合成法)分別合成 hBD-3、hBD-4、H4、3N41、MIX-M 和本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
多肽，如序列表的序列1所示、序列表的序列2所示、序列表的序列3所示或序列表的序列4所示。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王慧，李濤，劉雄，郭峰，郭通，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
還沒有人留言評(píng)論。發(fā)表了對(duì)其他瀏覽者有用的留言會(huì)獲得科技券。