本發明專利技術公開了一種突變hFGF-21蛋白成熟肽及其編碼基因和應用，以及聚乙二醇修飾的突變hFGF-21蛋白成熟肽及其應用。本發明專利技術提供的突變hFGF-21蛋白成熟肽為序列表的序列3所示的蛋白質。本發明專利技術還保護所述蛋白質與聚乙二醇的偶聯物，即將所述蛋白質進行聚乙二醇修飾。本發明專利技術提供的治療糖尿病的藥物具有良好的降血糖活性，特別是以所述偶聯物為活性成分的藥物，還具有穩定性高、半衰期長、免疫原性低等優點。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種突變hFGF-21蛋白成熟肽及其編碼基因和應用，以及聚乙二醇修飾的突變hFGF-21蛋白成熟肽及其應用。
技術介紹
糖尿病是血中胰島素絕對或相對不足，導致血糖過高，出現糖尿，進而引起脂肪和蛋白質代謝紊亂，臨床上可出現多尿、煩渴、多飲、多食，消瘦等表現，重者容易發生酮癥酸中毒等急性并發癥或血管、神經等慢性并發癥。糖尿病是一種常見的內分泌代謝性疾病，1980年我國患病率為0.67%，上海統計1978-1989年患病率由1.01%上升為2.23%，其中增加主要是2型患者。以上事實說明，隨著人們社會經濟生活的提高，糖尿病(特別是2型)病人有迅速增加的勢頭不容忽視。2000年，Tetsuya Nishimura等人最先在小鼠胚胎中分離出FGF家族中的一個新成員并將其命名為成纖維細胞生長因子-21 (FGF-21)。FGF-21是成纖維細胞生長因子家族的一名新成員，主要在肝臟中表達，蛋白N端前28個氨基酸為信號肽(去除信號肽后的多肽為成熟肽)，因此FGF21可以分泌到細胞外。FGF-21具有調節血糖、降低血脂和改善胰島素抵抗等作用，在醫藥領域有著廣泛的應用前景。但長期的研究及臨床實驗結果顯示，FGF-21與其他蛋白藥物一樣，穩定性差、體內半衰期短、易產生抗原抗體反應，這直接影響了其在臨床上的治療效果。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種突變hFGF-21蛋白成熟肽及其編碼基因和應用，以及聚乙二醇修飾的突變hFGF-21蛋白成熟肽及其應用。本專利技術提供的突變hFGF-21蛋白成熟肽為序列表的序列3所示的蛋白質。編碼所述蛋白質的基因也屬于本專利技術的保護范圍。所述基因具體可為如下I)或2)或3)或4)或5)的DNA分子:I)編碼區如序列表中序列4自5’末端第I至546位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列4所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子；4)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子。所述嚴格條件為在0.1 XSSPE (或0.1XSSC)、0.1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。本專利技術還保護所述蛋白質與聚乙二醇的偶聯物，即將所述蛋白質進行聚乙二醇修飾(又稱PEG化)。聚乙二醇修飾 是將活化的聚乙二醇通過化學方法偶聯到蛋白質、多肽、小分子有機藥物和脂質體上，從而增加具有藥效的蛋白質的穩定性，延長其體內半衰期，降低免疫原性。本專利技術還保護所述偶聯物的制備方法，包括如下步驟:在氰基硼氫化鈉的作用下，所述蛋白質與mPEG-ALD反應,得到所述偶聯物。所述反應中:所述蛋白質與mPEG-ALD的質量比具體可為1:4,所述反應具體可在pH6.0的朽1檬酸緩沖液中進行。所述反應的初始時刻，所述蛋白質的濃度可為2.0mg/ml。所述反應的初始時刻，氰基硼氫化鈉的加入量可為10倍于mPEG-ALD的摩爾數。所述反應的溫度具體可為4°C，時間具體可為8小時。所述mPEG-ALD的分子量為5kD到80kD，具體可為20kD_40kD。所述方法還可包括如下純化步驟:取含有所述偶聯物的反應液，用S印hadex G25脫鹽并將PEG-mFGF_21成熟肽置換于脫鹽緩沖液(pH8.0、20mM的Tris-HCl緩沖液),然后進行Capto Q陰離子交換層析。Capto Q陰離子交換層析的具體參數:XK16/26柱，柱高10cm，填充GE Capto Q陰離子交換樹脂；洗脫液為A液、B液或A液和B液的混合物，A液為pH8.0、20mM的Tris - HCl緩沖液，B液為含IM NaCl的pH8.0、20mM的Tris - HCl緩沖液；洗脫過程，0_20min，B液在洗脫液中的體積比由0%線性上升至100%，流速為10mL/min，收集電導在3ms/cm到20ms/cm之間的過柱后溶液，即為PEG-mFGF-21成熟肽溶液。本專利技術提供的偶聯物的制備方法，具有工藝簡單、修飾率和回收率高的優點。所述蛋白質或所述偶聯物可用于制備治療糖尿病的藥物。所述治療糖尿病的效果體現為降低血糖濃度。本專利技術還保護一種治療糖尿病的藥物，其活性成分為所述蛋白質或所述偶聯物。所述藥物還包括其它藥學上可接受的載體或輔料。所述藥物中，除了所述活性成分外，可以添加藥學上允許的賦形劑、填充劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、增效劑和添加劑等。所述藥物的給藥形態可為針劑(如粉劑、水劑、油劑)。所述制劑都可采用本領域技術人員熟知常用的制備方法而獲得。所述藥物的給藥途徑可為皮下注射、靜脈注射或肌肉注射。所述治療糖尿病的效果體現為降低血糖濃度。本專利技術提供的治 療糖尿病的藥物具有良好的降血糖活性，特別是以所述偶聯物為活性成分的藥物，還具有穩定性高、半衰期長、免疫原性低等優點。附圖說明圖1為實施例1的步驟三中上清液和沉淀進行12%SDS_PAGE電泳圖。圖2為實施例1的步驟三中融合蛋白溶液和mFGF-21成熟肽溶液的電泳圖。圖3為實施例1的步驟三中的親和層析圖譜。圖4為實施例2中細胞活性檢測的結果。圖5為實施例2中體內活性檢測的結果。圖6為實施例3中修飾物的選擇過程中的電泳圖。圖7為實施例3中pH選擇和反應時間選擇過程中的電泳圖。圖8為實施例3中mFGF-21成熟肽與mPEG-ALD的質量比和蛋白濃度選擇過程中的電泳圖。圖9為mPEG-ALD與mFGF-21成熟肽的偶聯示意圖。圖10為實施例5中分子量和純度檢測的結果。圖11為實施例5中溫度穩定性的測定結果。圖12為實施例6中PEG-mFGF-21成熟肽的免疫原性的測定結果。圖13為實施例7中PEG-m-FGF-21成熟肽體內穩定性的檢測結果。圖14為實施例8中PEG-mFGF-21成熟肽的體外細胞活性檢測結果。圖15為實施例9中PEG-mFGF-21體內生物學活性的檢測結果。具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本專利技術，但并不限定本專利技術。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。FGF-21成熟肽如序列表的序列I所示，其編碼基因如序列表的序列2所示。mFGF-21成熟肽如序列表的序列3所示，其編碼基因如序列表的序列4所示。原核表達載體pSUMO (在文獻中被稱為“pHisSUMO”):參考文獻:姜媛媛，尹成凱，李晉南，任桂萍，張薇，李德山.利用SUMO融合系統高效表達可溶性重組蛋白的研究.東北農業大學學報，2008, 39(10):57-62 ;李璐，尹成凱，李德山.高效表達可溶性重組蛋白表達載體——pHisSUM0.生物技術，2009, 19(3):11-14.。大腸桿菌Rosetta (DE3):北京全式金生物技術有限公司，目錄號:0)801。SUMO蛋白酶I (具有His標簽):制備方法見文獻:傅俊華，王琪，尹杰超，劉銘瑤，李寧，姚文兵 ，任桂萍，李璐，李德山.融合蛋白GST-Ulplp在大腸桿菌中的高效可溶性表達及其活性鑒定.生物工程學報，2010，26 (6):837-842.。HepG2細胞(人肝癌細胞):上海艾研生物科技有限公司。db/d本文檔來自技高網...
【技術保護點】
序列表的序列3所示的蛋白質。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：李德山，葉賢龍，任桂萍，孫國鵬，劉銘瑤，
申請(專利權)人：哈爾濱博翱生物醫藥技術開發有限公司，
類型：發明
國別省市：
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