樺木醇的分離純化及樺木酸的生物和化學(xué)轉(zhuǎn)化方法，它涉及樺木醇的分離純化及樺木酸的生物和化學(xué)轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)要解決現(xiàn)有制備樺木醇，分離樺木酸存在的收率低，純度和轉(zhuǎn)化率不高的問(wèn)題，本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)方法為：對(duì)樺樹(shù)皮原料在堿性條件下進(jìn)行瞬間的高溫高壓處理，采用乙醇進(jìn)行提取，過(guò)濾，結(jié)晶，再用氯仿/乙醇溶解重結(jié)晶，然后樺木醇氧化至樺木酮酸，將樺木酮酸還原至樺木酸；或者將枯草芽孢桿菌、高大毛霉或黃綠蜜環(huán)菌發(fā)酵菌液與樺木醇及緩沖液共同培養(yǎng)使樺木醇轉(zhuǎn)化成樺木酸。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)的方法工藝簡(jiǎn)單，產(chǎn)品純度高，操作方便，成本低，經(jīng)濟(jì)效益顯著。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專(zhuān)利技術(shù)涉及。
技術(shù)介紹
最近二十年，羽扇豆烷系列化合物的三萜類(lèi)用于多種疾病的治療。其中樺木醇為主要的一種三萜類(lèi)化合物，廣泛地分布在自然界中，并且被應(yīng)用于好多領(lǐng)域。因此已有大量文獻(xiàn)報(bào)告樺木醇及其衍生物研究和應(yīng)用的有重要性。樺木醇及其衍生物的分子結(jié)構(gòu)如下:權(quán)利要求1.樺木醇的分離純化及樺木酸的生物轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的樺木醇的分離純化及樺木酸的生物轉(zhuǎn)化方法是按照以下步驟進(jìn)行的: 一、取樺樹(shù)皮原料粉碎，水洗后，浸入質(zhì)量百分含量為2%的氫氧化鈉溶液中，在溫度為20(T240°C，壓力為1.2^3.4MPa的條件下處理3 5min，冷卻至室溫后，用水淋洗樺樹(shù)皮原料表面pH至中性，然后在105°C溫度下干燥f2h，得處理原料； 二、在溫度為75°C條件下，采用質(zhì)量百分含量為95%乙醇對(duì)步驟一得到的處理原料進(jìn)行回餾提取2h，重復(fù)回餾提取I次，合并提取液，將提取液蒸發(fā)濃縮至1/20體積，在溫度為5(T60°C條件下過(guò)濾，收集濾液，在溫度為4°C條件下結(jié)晶，收集結(jié)晶物，減壓干燥，得到樺木醇粗品； 三、將步驟二得到的樺木醇粗品用8倍體積的溶液溶解，濾出沉淀，收集上清液，在溫度為4°C的條件下重結(jié)晶，收集結(jié)晶物，減壓干燥，得到樺木醇結(jié)晶品；其中，溶液是由氯仿:無(wú)水乙醇按體積比為1:20的比例混合而成； 四、在液體培養(yǎng)基中加入菌培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)備培養(yǎng)，得到預(yù)備培養(yǎng)液；向預(yù)備培養(yǎng)液中加入步驟三得到的樺木醇 結(jié)晶品，然后在溫度為25°C 30°C、轉(zhuǎn)速為200r/min的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)18h，得到樺木酸轉(zhuǎn)化液，向樺木酸轉(zhuǎn)化液中加入正己烷，混合均勻，過(guò)硅膠層析柱，收集柱層析液，重結(jié)晶，得到樺木酸；其中，步驟二中所述的處理原料與質(zhì)量百分含量為95%乙醇的質(zhì)量體積比為lg:l(Tl5mL ;步驟四中所述的樺木醇結(jié)晶品與預(yù)備培養(yǎng)液的質(zhì)量體積比為Ig:9 llmL，樺木酸轉(zhuǎn)化液與正己烷的體積比為1:1，所述的菌為優(yōu)化的黃綠蜜環(huán)菌； 其中，所述的黃綠蜜環(huán)菌的菌種優(yōu)化方法如下: a、選取黃綠蜜環(huán)菌的出發(fā)菌株，重懸，吹干，取鏡檢無(wú)細(xì)胞重疊出發(fā)菌株置于水冷靶臺(tái)上平皿內(nèi)進(jìn)行N+離子注入，注入能量為20keV ;注入劑量為60X2.6 X IO13 200 X 2.6 X 1013ions / cm2、靶室真空度為2 X 10 ,脈沖注入時(shí)間為5s，注入時(shí)間間隔為55s，然后用無(wú)菌水洗脫，稀釋?zhuān)糠蛛x平皿，在恒溫箱中溫度為28°C條件下，培養(yǎng)4飛山挑選與出發(fā)菌菌落形態(tài)不同的單菌落轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基上，在溫度為28 V的條件下，活化培養(yǎng)4 5(1，制成含孢子數(shù)約KTlO7Cfu / mL的孢子懸浮液； b、將孢子懸浮液按1%的接種量接種于發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，在溫度為28°C、轉(zhuǎn)速為120r / min的條件下培養(yǎng)2d，再加入底物溶液，繼續(xù)在溫度為28°C、轉(zhuǎn)速為120r / min的條件下培養(yǎng)4d，測(cè)定發(fā)酵液中樺木酸的含量，篩選出樺木酸轉(zhuǎn)化得率高于黃綠蜜環(huán)菌出發(fā)菌株40-50%的高轉(zhuǎn)化率菌株，進(jìn)行連續(xù)傳代5次，即完成黃綠蜜環(huán)菌的菌種優(yōu)化； 所述的斜面培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，按質(zhì)量百分含量計(jì)是由30%的馬鈴薯、2%的葡萄糖、3%的瓊脂和余量的水組成； 發(fā)酵液體培養(yǎng)基，按質(zhì)量百分含量計(jì)是由30%的馬鈴薯、2%的葡萄糖和余量的水組成； 底物溶液為質(zhì)量百分含量為90%的樺木醇溶解于二甲基亞砜而成的濃度為7 8mg /mL的溶液。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的樺木醇的分離純化及樺木酸的生物轉(zhuǎn)化方法，其特征在于步驟四中所述的預(yù)備培養(yǎng)具體操作如下:取4mnT5mm2斜面培養(yǎng)菌絲體，采用無(wú)菌水將黃綠蜜環(huán)菌絲體稀釋成孢子數(shù)含量為106cfu/mL的孢子懸浮液，將孢子懸浮液按1%的接種量接種于液體培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為120r/min，溫度為25°C 30°C的條件下恒溫振蕩培養(yǎng)48h，得預(yù)備培養(yǎng)液；其中，液體培養(yǎng)基為馬鈴薯綜合培養(yǎng)基，按質(zhì)量百分含量計(jì)，是由2%的可溶性淀粉、I %的葡萄糖、0.5%的蛋白胨、0.5%的酵母膏、0.3%的尿素、0.2%的ΚΗΡ04、0.1%的MgSO4.7Η20、0.003%的 FeSO4 和余量的水組成，pH 為 7.0。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的樺木醇的分離純化及樺木酸的生物轉(zhuǎn)化方法，其特征在于步驟二中所述的處理原料與質(zhì)量百分含量為95%乙醇的質(zhì)量體積比為lg:5 8mL。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的樺木醇的分離純化及樺木酸的生物轉(zhuǎn)化方法，其特征在于步驟四中所述的樺木醇結(jié)晶品與預(yù)備培養(yǎng)液的質(zhì)量體積比為Ig:10mL。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的樺木醇的分離純化及樺木酸的生物轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的篩選出樺木酸轉(zhuǎn)化得率高于黃綠蜜環(huán)菌出發(fā)菌株50%的高轉(zhuǎn)化率菌株。6.樺木醇的分離純化及樺木酸的化學(xué)轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的樺木醇的分離純化及樺木酸的化學(xué)轉(zhuǎn)化方法 是按照以下步驟進(jìn)行的: 一、取樺樹(shù)皮原料粉碎，水洗后，浸入質(zhì)量百分含量為2%的氫氧化鈉溶液中，在溫度為20(T240°C，壓力為1.2^3.4MPa的條件下處理3飛min，冷卻至室溫后，用水淋洗樺樹(shù)皮原料表面pH至中性，然后在105°C溫度下干燥f2h，得處理原料； 二、在溫度為75°C條件下，采用質(zhì)量百分含量為95%乙醇對(duì)步驟一得到的處理原料進(jìn)行回餾提取2h，重復(fù)回餾提取I次，合并提取液，將提取液蒸發(fā)濃縮至1/20體積，在溫度為5(T60°C條件下過(guò)濾，收集濾液，在溫度為4°C條件下結(jié)晶，收集結(jié)晶物，減壓干燥，得到樺木醇粗品； 三、將步驟二得到的樺木醇粗品用8倍體積的溶液溶解，濾出沉淀，收集上清液在溫度為4°C的條件下重結(jié)晶，收集結(jié)晶物，減壓干燥，得到樺木醇結(jié)晶品；其中，溶液是由氯仿:無(wú)水乙醇按體積比為1:20的比例混合而成； 四、取步驟三得到的樺木醇結(jié)晶品，在攪拌條件下，用丙酮溶解，然后冷卻至50C 10°C，按樺木醇結(jié)晶品與瓊斯試劑摩爾比為1:5 7的比例混合均勻，在溫度為20°C條件下反應(yīng)3h，過(guò)濾，去除沉淀，收集濾液減壓干燥，將干燥后的固相物用乙酸乙酯提取，收集有機(jī)相乙酸乙酯，依次用等體積的蒸餾水和等體積的質(zhì)量百分含量為10%碳酸氫鈉溶液洗滌，然后用無(wú)水硫酸鎂干燥，得樺木酮酸粗品；用8 10倍體積乙醚溶解樺木酮酸粗品，過(guò)硅膠層析柱，收集柱層析液，減壓干燥，得樺木酮酸純品，然后用硼氫化鈉/四氫呋喃還原，生成樺木酸粗提物；將樺木酸粗提物與甲醇按質(zhì)量體積比為Ig:20mL的比例混合，加熱煮沸15 20min，冷卻至室溫重結(jié)晶，即得樺木酸； 其中，步驟二中所述的處理原料與質(zhì)量百分含量為95%乙醇的質(zhì)量體積比為lg:l(Tl5mL ;步驟四中所述的樺木醇結(jié)晶品與丙酮的質(zhì)量體積比為Ig:2飛mL ;步驟四中所述的固相物與乙酸乙酯的質(zhì)量體積比為Ig:10mL，樺木酮酸純品與硼氫化鈉/四氫呋喃的質(zhì)量體積比為Ig:3 5mL。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的樺木醇的分離純化及樺木酸的化學(xué)轉(zhuǎn)化方法，其特征在于步驟二中所述的處理原料與質(zhì)量百分含量為95%乙醇的質(zhì)量體積比為lg:5 8mL。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的樺木醇的分離純化及樺木酸的化學(xué)轉(zhuǎn)化方法，其特征在于步驟四中所述的樺木醇結(jié)晶品與丙酮的質(zhì)量體積比為Ig:3.5mL。9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的樺木醇的分離純化及樺木本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
樺木醇的分離純化及樺木酸的生物轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的樺木醇的分離純化及樺木酸的生物轉(zhuǎn)化方法是按照以下步驟進(jìn)行的：一、取樺樹(shù)皮原料粉碎，水洗后，浸入質(zhì)量百分含量為2%的氫氧化鈉溶液中，在溫度為200~240℃，壓力為1.2~3.4MPa的條件下處理3~5min，冷卻至室溫后，用水淋洗樺樹(shù)皮原料表面pH至中性，然后在105℃溫度下干燥1~2h，得處理原料；二、在溫度為75℃條件下，采用質(zhì)量百分含量為95%乙醇對(duì)步驟一得到的處理原料進(jìn)行回餾提取2h，重復(fù)回餾提取1次，合并提取液，將提取液蒸發(fā)濃縮至1/20體積，在溫度為50~60℃條件下過(guò)濾，收集濾液，在溫度為4℃條件下結(jié)晶，收集結(jié)晶物，減壓干燥，得到樺木醇粗品；三、將步驟二得到的樺木醇粗品用8倍體積的溶液溶解，濾出沉淀，收集上清液，在溫度為4℃的條件下重結(jié)晶，收集結(jié)晶物，減壓干燥，得到樺木醇結(jié)晶品；其中，溶液是由氯仿:無(wú)水乙醇按體積比為1:20的比例混合而成；四、在液體培養(yǎng)基中加入菌培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)備培養(yǎng)，得到預(yù)備培養(yǎng)液；向預(yù)備培養(yǎng)液中加入步驟三得到的樺木醇結(jié)晶品，然后在溫度為25℃~30℃、轉(zhuǎn)速為200r/min的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)18h，得到樺木酸轉(zhuǎn)化液，向樺木酸轉(zhuǎn)化液中加入正己烷，混合均勻，過(guò)硅膠層析柱，收集柱層析液，重結(jié)晶，得到樺木酸；其中，步驟二中所述的處理原料與質(zhì)量百分含量為95%乙醇的質(zhì)量體積比為1g:10~15mL；步驟四中所述的樺木醇結(jié)晶品與預(yù)備培養(yǎng)液的質(zhì)量體積比為1g：9~11mL，樺木酸轉(zhuǎn)化液與正己烷的體積比為1：1，所述的菌為優(yōu)化的黃綠蜜環(huán)菌；其中，所述的黃綠蜜環(huán)菌的菌種優(yōu)化方法如下：a、選取黃綠蜜環(huán)菌的出發(fā)菌株，重懸，吹干，取鏡檢無(wú)細(xì)胞重疊出發(fā)菌株置于水冷靶臺(tái)上平皿內(nèi)進(jìn)行N+離子注入，注入能量為20keV；注入劑量為60×2.6×1013~200×2.6×1013ions／cm2、靶室真空度為2×10?3Pa，脈沖注入時(shí)間為5s，注入時(shí)間間隔為55s，然后用無(wú)菌水洗脫，稀釋?zhuān)糠蛛x平皿，在恒溫箱中溫度為28℃條件下，培養(yǎng)4~5d，挑選與出發(fā)菌菌落形態(tài)不同的單菌落轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基上，在溫度為28℃的條件下，活化培養(yǎng)4~5d，制成含孢子數(shù)約105~107cfu／mL的孢子懸浮液；b、將孢子懸浮液按1%的接種量接種于發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，在溫度為28℃、轉(zhuǎn)速為120r／min的條件下培養(yǎng)2d，再加入底物溶液，繼續(xù)在溫度為28℃、轉(zhuǎn)速為120r／min的條件下培養(yǎng)4d，測(cè)定發(fā)酵液中樺木酸的含量，篩選出樺木酸轉(zhuǎn)化得率高于黃綠蜜環(huán)菌出發(fā)菌株40?50％的高轉(zhuǎn)化率菌株，進(jìn)行連續(xù)傳代5次，即完成黃綠蜜環(huán)菌的菌種優(yōu)化；所述的斜面培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，按質(zhì)量百分含量計(jì)是由30％的馬鈴薯、2％的葡萄糖、3％的瓊脂和余量的水組成；發(fā)酵液體培養(yǎng)基，按質(zhì)量百分含量計(jì)是由30％的馬鈴薯、2％的葡萄糖和余量的水組成；底物溶液為質(zhì)量百分含量為90％的樺木醇溶解于二甲基亞砜而成的濃度為7~8mg／mL的溶液。...
【技術(shù)特征摘要】
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張宏偉，王雷，王東凱，邢巖，李鵬，林琳，楊志興，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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