多基因修飾iPS細胞分化為胰島素分泌細胞的方法技術

本發明專利技術公開了一種多基因修飾iPS細胞分化為胰島素分泌細胞的方法，包括含目的基因PDX-1，NeuroD，MafA腺病毒包裝、小鼠胚胎成纖維細胞的分離培養及飼養細胞的制備、MEFs受染重編程為小鼠iPS細胞、小鼠iPS細胞受染分化為胰島素分泌細胞。本發明專利技術方法簡便、易操作、效果好。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種。
技術介紹
誘導多能干細胞(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)是將成體細胞重編程為具有多分化潛能的干細胞，它在形態學、表觀遺傳學、全基因表達譜及分化潛能方面與胚胎干細胞(ESCs)極其相似，其優點是個體特異來源的iPS細胞能避免免疫排斥問題。同時iPS細胞生成技術不涉及胚胎毀損等倫理學問題?？茖W研究等工作中需要多基因修飾iPS細胞分化為胰島素分泌細胞。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種方法簡便、易操作、效果好的。本專利技術的技術解決方案是:一種，其特征是:包括下列步驟: (一)含目的基因PDX-1，NeuroD,MafA腺病毒包裝(I)轉染前質粒的準備1.1重組質粒Pac I單酶切，37°C酶切2h ；1.2采用經典酚氯仿抽提法對單酶切質粒進行純化，用紫外分光光度計測定純化質權濃度；(2)轉染2.1取處于對數生長期的293A細胞，用0.05%胰酶消化，細胞計數后，按照每孔4.5X105個細胞，種于6孔板，37°C，5%C02的培養箱中培養過夜；2.2第二天轉染前移去培養液，換2ml Opt1-MEM培養液；2.3取2 μ g線性化的質粒加入250 μ I經37°C預熱的Opt1-MEM中，混勻；2.4取5“ llipofectamine2000 加入 250μ I Opt1-ΜΕΜ 中，混勻，室溫放置 5min ；2.5將500 μ I復合物加入到細胞孔中，搖動培養板，混勻；在37°C，5%的CO2的培養箱中培養5-6小時后,換上完全培養液,繼續置培養箱中培養；2.6轉染后48小時，用0.05%胰酶消化細胞，并轉移至IOcm培養皿中，加入IOml完全培養基；2.7每2-3天換入新鮮培養基，觀察是否有病變效應出現；2.8讓感染繼續發生，直至80%細胞出現病變效應；收集細胞及上清液至滅菌的15ml離心管，_80°C保存；(3)用反復凍融法使病毒從細胞中釋放出來，離心收集初級病毒液；(4)初級病毒液的擴增4.1病毒感染前一天對293A細胞進行計數，在IOcm培養皿中以3X IO6細胞種板，以保證轉導時細胞密度達到90% ；4.2感染時在IOcm皿中加入100 μ I初級病毒液，混勻；4.3在37°C，5%的CO2的培養箱中培養至80-90%細胞變圓并漂?。?.4收集細胞至滅菌的15ml離心管；4.5將收集的細胞置于_80°C，30分鐘，隨后置于37°C 15分鐘；反復凍融3次使病毒從細胞中釋放出來；4.6室溫下3000rpm離心15分鐘，除去細胞碎片；4.7將病毒原液在50000g下超速離心2小時，去除上清，重懸于1.5ml DMEM培養液中，分裝小管，放置于_80°C保存備用；(二)小鼠胚胎成纖維細胞的分離培養及飼養細胞的制備(I)性成熟C57BL/6J小鼠按I公:2母比例合籠；(2)每天早上觀察母小鼠陰道口，有陰道栓確定為懷孕，見栓當天上午定為懷孕的0.5 天； (3)取懷孕12.5 13.5天母鼠，斷頸處死，取出胎鼠，將胎鼠軀干部分置于一盛有PBS的平皿內，用PBS至少洗滌3次，充分棄除紅細胞；(7)用顯微剪將鼠胚軀干剪成lmm3以下的碎塊，吸置于離心管內；(8)室溫下靜置5分鐘，棄上層液，留下胚胎組織碎塊；(9)向裝有鼠胚組織碎塊的離心管內加入2ml0.05%胰蛋白酶，輕輕吹吸30秒，靜置5分鐘后吸出上清于MEF培養基中，反復多次以上操作直至組織塊消失；(10)離心后重懸細胞于MEF培養基中，待細胞80%_90%融合時傳代或凍存；(11)在第3 5代MEFs的培養上清中加入絲裂霉素C，使絲裂霉素C的終濃度為10 μ g/ml，放回培養箱處理2.5小時；(12)將0.1%明膠水溶液吸入培養瓶內，覆蓋培養瓶底面，室溫下靜置2小時后吸棄明膠水溶液，用PBS洗滌一次；(13)棄含有絲裂霉素C的MEFs培養上清，PBS洗滌5遍；(14)消化經絲裂霉素C處理的MEFs，種植到預先用明膠處理過的培養瓶內，種植的細胞數為6 X IO4個/cm2 ；(15)待細胞貼壁后進行觀察，如細胞過稀則補加細胞，保證細胞能連成一片而沒有間隙，為飼養層細胞；(16)將制備好的飼養層細胞放置在培養箱內備用；在5天內使用，使用前要更換培養基為胚胎干細胞培養基；(三)MEFs受染重編程為小鼠iPS細胞(I)先用0.1%明膠預包被一個T25瓶，包被時間為10分鐘；(2)用0.25%trypsin/EDTA消化第三代MEFs，收集到一個15ml離心管中，用血小板計數板計數，取出IXIO5個細胞用于感染實驗所需的細胞量；(3)將所需的含有目的基因0Ct4、SOX2、Klf4、CMyC的慢病毒及表達rtTA的慢病毒加入一個15ml離心管中，混勻后，用0.45 μ m過濾器過濾以去除其中的細胞碎片等雜質；(4)將IXlO5的細胞加入已經過濾好的病毒溶液中，溶液體積最后補足至5ml，最后加入5μ I助轉劑polybrene,助轉劑polybrene使用濃度為10 μ g/ml,將整個體系混勻后，轉移到已經預包被好的T25瓶中，搖勻后放入37° C培養箱中，10小時后去病毒；(5)將上述慢病毒感染后的細胞用0.25%trypsin/EDTA消化下來，按六孔板每孔IXio4的細胞量鋪到事先準備好的飼養層細胞上；(6)第2天，將MEF培養基換成mESC培養基，繼續培養，以后每2天換液一次；(7)細胞長至第13天左右，挑克隆，將mESC樣的克隆挑至新的飼養層細胞上，用mESC培養基繼續培養，擴增；得到小鼠iPS細胞；(四)小鼠iPS細胞受染分化為胰島素分泌細胞(I)小鼠iPS細胞用0.25%trypsin/EDTA消化后用mESC培養基重懸于IOOmm細胞培養皿中，50分鐘后吸出上清，用細胞計數板計數；(2)將所需的分別含目的基因rox-l，NeuroD, MafA的腺病毒載體Ad-mPDX-l-1RES-GFP、Ad - mNeuroD-1RES-GFP 及 AdiMafA-1RES-GFP 加入一個 15ml 離心管中，混勻后，用0.45 μ m過濾器過濾以去除其中的細胞碎片等雜質；(3)將小鼠iPS細胞加入已經過濾好的病毒溶液中，加入MEF培養基后重懸于超低吸附六孔板中，2ml/孔，讓病毒維持在MEF培養基中2天，第4天重復轉導胚體一次；(4) 6天后收集胚體，用MEF培養基重懸于普通六孔板中；(5)待大量細胞自胚 體爬出時消化傳代。本專利技術方法簡便、易操作、效果好。附圖說明下面結合附圖和實施例對本專利技術作進一步說明。圖1小鼠iPS細胞克隆在顯微鏡下的形態(X 200)圖。圖2 (A)第16代小鼠iPS細胞克隆的堿性磷酸酶染色(X 200) (B)第16代小鼠iPS細胞克隆的干細胞表面標記Nanog、ReX-l及SSEA-1的免疫熒光染色(X400) (C)小鼠iPS細胞干細胞內源基因的RT-PCR檢測結果(D)小鼠iPS細胞的核型圖。圖3A)小鼠iPS細胞來源的胚體在體視顯微鏡下的形態(X60) (B)小鼠iPS細胞來源的胚體三胚層基因的RT-PCR檢測結果(C)小鼠iPS細胞形成畸胎瘤的HE染色。圖4是I3DX-UNeuroD和MafA轉染的小鼠iPS在熒光顯微鏡下同一視野的明視本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種多基因修飾iPS細胞分化為胰島素分泌細胞的方法，其特征是：包括下列步驟：（一）含目的基因PDX?1，NeuroD，MafA腺病毒包裝（1）轉染前質粒的準備1.1??重組質粒Pac?I單酶切，37℃酶切2h；1.2??采用經典酚氯仿抽提法對單酶切質粒進行純化，用紫外分光光度計測定純化質粒濃度；（2）轉染2.1取處于對數生長期的293A細胞，用0.05%胰酶消化，細胞計數后，按照每孔4.5×105個細胞，種于6孔板，37℃，5%CO2?的培養箱中培養過夜；2.2第二天轉染前移去培養液，換2ml?Opti?MEM培養液；2.3取2μg線性化的質粒加入250μl經37℃預熱的Opti?MEM中，混勻；2.4取5μl?lipofectamine2000?加入250μl?Opti?MEM中，混勻，室溫放置5min；2.5將500μl復合物加入到細胞孔中，搖動培養板，混勻；在37℃，5％的CO2的培養箱中培養5?6小時后，換上完全培養液，繼續置培養箱中培養；2.6轉染后48小時，用0.05%胰酶消化細胞，并轉移至10cm培養皿中，加入10ml完全培養基；2.7每2?3天換入新鮮培養基，觀察是否有病變效應出現；2.8讓感染繼續發生，直至80%細胞出現病變效應；收集細胞及上清液至滅菌的15ml離心管，?80℃保存；（3）用反復凍融法使病毒從細胞中釋放出來，離心收集初級病毒液；（4）初級病毒液的擴增4.1病毒感染前一天對293A細胞進行計數，在10cm培養皿中以3×106細胞種板，以保證轉導時細胞密度達到90%；4.2感染時在10cm皿中加入100μl初級病毒液，混勻；4.3在37℃，5％的CO2的培養箱中培養至80?90%細胞變圓并漂??；4.4收集細胞至滅菌的15ml離心管；?4.5將收集的細胞置于?80℃，30分鐘，隨后置于37℃?15分鐘；反復凍融3次使病毒從細胞中釋放出來；4.6室溫下3000rpm離心15分鐘，除去細胞碎片；4.7將病毒原液在50000g下超速離心2小時，去除上清，重懸于1.5ml?DMEM培養液中，分裝小管，放置于?80℃保存備用；（二）小鼠胚胎成纖維細胞的分離培養及飼養細胞的制備（1）性成熟C57BL/6J小鼠按1公：2母比例合籠；（2）每天早上觀察母小鼠陰道口，有陰道栓確定為懷孕，見栓當天上午定為懷孕的0.5天；（3）取懷孕12.5～13.5天母鼠，斷頸處死，取出胎鼠，將胎鼠軀干部分置于一盛有PBS的平皿內，用PBS至少洗滌3次，充分棄除紅細胞；（4）用顯微剪將鼠胚軀干剪成1mm3以下的碎塊，吸置于離心管內；（5）室溫下靜置5分鐘，棄上層液，留下胚胎組織碎塊；（6）向裝有鼠胚組織碎塊的離心管內加入2ml?0.05%胰蛋白酶，輕輕吹吸30秒，靜置5分鐘后吸出上清于MEF培養基中，反復多次以上操作直至組織塊消失；（7）離心后重懸細胞于MEF培養基中，待細胞80%?90%融合時傳代或凍存；（8）在第3～5代MEFs的培養上清中加入絲裂霉素C，使絲裂霉素C的終濃度為10μg/ml，放回培養箱處理2.5小時；（9）將0.1%明膠水溶液吸入培養瓶內，覆蓋培養瓶底面，室溫下靜置2小時后吸棄明膠水溶液，用PBS洗滌一次；（10）棄含有絲裂霉素C的MEFs培養上清，PBS洗滌5遍；（11）消化經絲裂霉素C處理的MEFs，種植到預先用明膠處理過的培養瓶內，種植的細胞數為6×104個/cm2；（12）待細胞貼壁后進行觀察，如細胞過稀則補加細胞，保證細胞能連成一片而沒有間隙，為飼養層細胞；（13）將制備好的飼養層細胞放置在培養箱內備用；在5天內使用，使用前要更換培養基為胚胎干細胞培養基；（三）MEFs受染重編程為小鼠iPS細胞?（1）先用0.1%明膠預包被一個T25瓶，包被時間為10分鐘；（2）用0.25%?trypsin/EDTA消化第三代MEFs，收集到一個15ml離心管中，用血小板計數板計數，取出1×105個細胞用于感染實驗所需的細胞量；（3）將所需的含有目的基因Oct4、Sox2、Klf4、cMyc的慢病毒及表達rtTA的慢病毒加入一個15ml離心管中，混勻后，用0.45μm過濾器過濾以去除其中的細胞碎片等雜質；（4）將1×105的細胞加入已經過濾好的病毒溶液中，溶液體積最后補足至5ml，最后加入5μl助轉劑polybrene，助轉劑polybrene使用濃度為10μg/ml，將整個體系混勻后，轉移到已經預包被好的T25瓶中，搖勻后放入37°C培養箱中，10小時后去病毒；（5）將上述慢病毒感染后的細胞用0.25%?trypsin/...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：王志偉，朱銘巖，范向軍，陸玉華，朱沙俊，王堯，郭青松，王雷，黃龑，薄祥坤，常旭，袁驍琪，張太哲，
申請(專利權)人：南通大學附屬醫院，
類型：發明
國別省市：