胰島的分離方法及用于保護胰島組織的保護液技術

本發明專利技術涉及一種胰島的分離方法及能夠用于該方法的保護液，所述胰島的分離方法包括下述工序：在摘出的胰臟的胰管內注入保存液的注入工序；將上述胰臟浸漬在浸漬液中進行保存的保存工序；破壞上述胰臟得到胰組織的消化工序；和將上述胰組織浸漬在純化溶液中得到胰島的純化工序，其特征在于，上述消化工序包括：將含有消化酶的酶溶液注入上述胰臟的內部的酶注入步驟；使上述消化酶活化的消化開始步驟；使上述消化酶失活的消化停止步驟；和將已被破壞的胰組織回收的回收步驟，通過在上述消化開始步驟之前向體系中添加嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑，從而在開始上述消化開始步驟的時刻，使嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑存在于上述胰臟的內部，通過使用上述胰島的分離方法及能夠用于該方法的保護液，能夠以高產量得到適合移植的形狀及大小的胰島。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及從胰臟分離能夠移植的胰島的方法及在該分離方法中用于保護胰島組織的保護液。
技術介紹
I型糖尿病的根治方法例如有從腦死亡者移植胰臟本身的胰臟移植。所述胰臟移植僅通過I次移植就能脫離胰島素等，效果好。但是，外科手術復雜、而且伴隨血液循環再建，也可能引起并發癥，因此存在對患者身體造成很大負擔的問題。因此，近年來，胰島移植作為新的糖尿病根治方法受到關注。所謂胰島移植，是將作為調節血糖的激素的胰島素或胰高血糖素的分泌組織即胰島從胰臟分離，將分離的胰島從門靜脈向肝臟移植的方法。被 移植的胰島成活在肝臟內的門靜脈末端，由此分泌胰島素。現有的胰臟移植為伴有高侵襲性的外科處置，與此相對，該胰島移植是在門靜脈留置導管，按照靜脈滴注的要領移植胰島進行處置即可，因此與胰臟移植相比，患者身體的負擔較輕并且安全。另外，胰島移植與其他臟器移植不同，其為細胞移植的一種，因此能夠將胰島半永久地冷凍保存。進而，胰島移植時還存在下述優點即使發生排斥反應，由于移植的胰島本身被吸收，所以也無需更換摘除細胞。另一方面，胰島移植存在下述缺點，S卩，由于從胰臟僅分離胰島細胞在技術上的困難性，所以不能獲得適合移植的充分產量的胰島。結果，需要多次的移植才能實現胰島素脫離，需要接受來自平均2. 6人的供體的胰臟提供。因此，如何能夠從胰臟更多地獲得質量優異的胰島成為課題。為了解決該課題，一直以來研究了各種胰島分離方法。例如，專利文獻I中公開了特征在于將含有蛋白酶抑制劑的保護液預先注入胰管內的胰島的分離方法。該胰島的分離方法中的蛋白酶抑制劑用于提高胰島的產量。在現有的胰島分離方法中，不能得到質量及產量充分的胰島的原因如非專利文獻I所公開的那樣，是因為存在于胰臟內的來自胰外分泌腺的內源酶由于胰臟的摘出而被活化，損傷胰臟組織，之前的胰島分離方法通過采取抑制內源酶活性的手段，以求改善胰島的質量及產量。來自胰外分泌腺的酶有胰蛋白酶、來自胰的彈性蛋白酶、糜蛋白酶等，上述專利文獻I中使用特異性抑制胰蛋白酶的烏司他丁。專利文獻I中指出，作為通過蛋白酶抑制劑適當地保護胰島的組織的結果，胰島的產量增大。但是，現有的方法在分離的過程中胰島細胞被撕裂等、通常受到物理損傷，不能以必要的產量穩定地獲得在移植后分泌充分的胰島素的大小和形狀的胰島。另外，專利文獻I中，用作蛋白酶抑制劑的烏司他丁是以人尿作為原料的生物來源制劑，也存在對于生物體的風險高、缺乏安全性的問題。專利文獻I :國際公開第2006/068226號非專利文獻I Transplantation Proceedings, 2003, Vol. 35, no. 7,2455-
技術實現思路
因此，本專利技術的目的在于提供一種胰島的分離方法及用于保護胰島組織的保護液，所述胰島的分離方法能夠以高產量獲得適合移植的形狀及大小的胰島。本專利技術人等在進行本專利技術時，新發現了若供體的嗜中性粒細胞事先浸潤在摘出后的胰臟內，經過消化的工序,則其數量增加,并且從該嗜中性粒細胞釋放的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶對胰島造成損傷。因此，專利技術人等著眼于通過抑制所述嗜中性粒細胞彈性蛋白酶的作用能有效地遏制胰島的損傷，從而完成了本專利技術。本專利技術涉及以下內容。 一種胰島的分離方法，包括下述工序將摘出的胰臟破壞得到胰組織的消化工序；和 將上述胰組織浸潰在純化溶液中得到胰島的純化工序，其特征在于，上述消化工序包括下述步驟將含有消化酶的酶溶液注入上述胰臟的內部的酶注入步驟；使上述消化酶活化的消化開始步驟；使上述消化酶失活的消化停止步驟；和將已被破壞的胰組織回收的回收步驟，通過在上述消化開始步驟之前添加嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑，從而在開始上述消化開始步驟的時刻，使嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑存在于上述胰臟的內部。如所述的胰島的分離方法，其特征在于，在上述消化工序之前，還包括向摘出的胰臟的胰管內注入保存液的注入工序及/或將上述胰臟浸潰在浸潰液中進行保存的保存工序。如或所述的胰島的分離方法，其特征在于，上述嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑的添加通過向上述酶溶液中添加嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑來進行。如或所述的胰島的分離方法，其特征在于，上述嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑的添加通過向上述酶溶液及上述純化溶液中添加嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑來進行。如所述的胰島的分離方法，其特征在于，上述嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑的添加通過向上述保存液、上述浸潰液、上述酶溶液及上述純化溶液的各個溶液中均添加嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑來進行。如 中任一項所述的胰島的分離方法，其特征在于，上述保存液、上述浸潰液、上述酶溶液及上述純化溶液中的上述嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑的濃度為2 200 μ Μ。 一種保護液，用于保護上述胰組織免受由浸潤在胰組織中的嗜中性粒細胞所釋放出的彈性蛋白酶的作用，其特征在于，含有嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑。如所述的保護液，其特征在于，上述保護液中的上述嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑的濃度為2 200 μ M0此處，所謂保護液是指本專利技術的胰島分離方法中使用的保存液、浸潰液、酶溶液或純化溶液等中添加了嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑而得到的液體。根據本專利技術，在胰島的分離方法中，能夠以高產量得到適合移植的形狀及大小的胰島。附圖說明(a) (d)為表示嗜中性粒細胞向胰臟的浸潤程度的圖。為表示胰島分離的各工序中的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶活性的圖。為表示嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑的最佳濃度的圖。為表示實施例及比較例中所示的胰島分離方法的各工序中的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶的活性的圖。為表示所得的胰島的IEQ(IsletEquivalent)的圖。 為表示所得的胰島的分離指數(IsolationIndex)的圖。為表示所得的胰島的純度的圖。為表示所得的胰島的長徑分布的圖。(a) ⑷為所得胰島的電子顯微鏡照片。為表示所得胰島的刺激指數(StimulationIndex)的圖。具體實施例方式以下，說明本專利技術的胰島分離方法。本專利技術的胰島分離方法包括⑴向胰管內注入保存液的“注入工序”；⑵使胰臟浸潰在浸潰液中進行保存的“保存工序”；(3)破壞胰臟的“消化工序”；(4)從破壞而得到的胰組織純化胰島的“純化工序”。并且，消化工序包括以下操作步驟將酶溶液注入胰臟的胰管內使其膨脹的“酶注入步驟”；開始消化使胰臟破壞的“消化開始步驟”;停止胰組織的進一步消化的步驟“消化停止步驟”;和將已被破壞的胰組織回收，任意地清洗及濃縮的“回收步驟”。上述步驟中，本專利技術的特征在于，至少在消化開始步驟的操作開始的時刻，使嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑存在于膜臟內部。接下來，說明本專利技術的胰島分離方法中的各工序。(I)注入工序作為胰島分離方法的最初工序，將保存液注入胰管內。保存液的注入例如可以通過在胰管中插入導管來進行。此時，可以利用泵調節注入壓。插入的導管的數量優選為I根。通過為I根，能夠減少注入胰管內的溶液的漏液，也能將臟器的損傷控制在最小限。保存液的滲透壓為270 450m0sm/l，優選為300 400m0sm/l。滲透壓在上述范圍內時，在將保存液注入胰管內后，能夠防止保存中胰組織膨脹或收縮。另外，為了防止細胞或組織的酸性分解等，保存液的PH優選為7 8左右。注入胰管的保存液中含有臟器保存液。作為臟器保存液，可本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：種村匡弘，澤芳樹，名井陽，伊藤壽記，森正樹，土岐祐一郎，
申請(專利權)人：株式會社大塚制藥工場，
類型：
國別省市：