用于培養脂肪細胞的方法技術

本發明專利技術涉及用于培養脂肪細胞的方法，其中分離自脂肪組織的成熟脂肪細胞的同質群培養于三維培養基質上。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及，涉及脂肪細胞培養物，及其用于篩選調節脂肪細胞代謝的化合物的用途。
技術介紹
與白色脂肪組織肥大有關的肥胖的患病率，在普通公眾當中持續增加。因此，在法國從1997年至2003年之間，超重或肥胖的個體的比例已經從36. 7%增加到41. 6%;此外，2009年法國的肥胖患病率(定義為大于30kg/m2的身體質量指數(BMI (法文原文為MC)))為14. 5%。此外，肥胖是許多病理疾病(包括特別是心血管事件)的風險因素，這使得其治療性治療顯得更為迫切。 然而，對抗這一流行病的主要方式仍是改善肥胖個體的飲食和增加體育鍛煉，還探索了其它方法，尤其是外科和基于藥物的方法。目前基于藥物的方法主要目的在于減少能量攝入，例如通過限制脂質的腸吸收(奧利司他)，或者通過促進飽腹的感覺(西布曲明)，或通過減少食品攝入相關的快感(利莫那班)的降低食欲。然而，這些方法的效果有限或者有副作用一因此還有報道，利莫那班可導致嚴重的抑郁癥一尤其已經導致西布曲明和利莫那班從市場上的召回，使得治療選擇非常有限，并且使得有必要探索其它方法，使得有可能例如調節脂肪細胞的代謝以便限制脂質存儲，或反之，促進其利用。然而，由于缺乏真正代表人類體內情況的用于研究脂肪細胞代謝的體外或動物模型，后一種方法難以處理。事實上，至于體外模型，形成白色脂肪組織的成熟脂肪細胞(特別是特征在于存在單一脂質液泡)尤其脆弱，并且事實上這些細胞通常在48小時之內在培養中失去它們的代謝和分泌特性。因此，為克服這些困難，提出了一些培養系統。然而，除了脂肪細胞以外，這些培養物包括附屬細胞類型，如前脂肪細胞或內皮細胞(Sonda等人，(2008)Endocrinology149:4794-4798)、或者通常采用從干細胞體外分化的脂肪細胞進行制備(Choi等人，(2010)Tissue Engineering:Part C，Kang et al. (2007)Biomaterials 28:450-458)、或者來自前脂肪細胞(Daya 等人，(2007)Differentiation 75 :360-370, W02007/113591、Stacey 等人，(2009)Tissue Engineering:Part A15:3389-3399),其表型和分離自脂肪組織的成熟脂肪細胞差距相對較遠(參見圖I至圖3)。因此，這些系統顯得不能特異性地且直接地代表分離自脂肪組織的成熟脂肪細胞的代謝。因此，本專利技術的一個目的在于提供這樣的培養系統，其接近生理情況，特別是接近人體生理。
技術實現思路
本專利技術來自由本專利技術人所提供的意想不到的展示，即在沒有其它細胞類型的情況下，使用三維培養基質可以培養分離自脂肪組織的成熟脂肪細胞，以及這樣培養的脂肪細胞至少保持48h，表型和新鮮分離的成熟脂肪細胞相似。因此，本專利技術涉及，其中在三維培養基質上培養分離自脂肪組織的成熟脂肪細胞的同質群。本專利技術還涉及脂肪細胞培養物，其包括接觸三維培養基質的分離自脂肪組織的成熟脂肪細胞的單培養物。本專利技術還涉及根據本專利技術的脂肪細胞培養物用于篩選調節脂肪細胞代謝的化合物的用途。·本專利技術還涉及一種用于篩選調節脂肪細胞代謝的化合物的方法，其中-使要篩選的化合物接觸根據本專利技術的脂肪細胞培養物；-確定與未接觸要篩選的化合物的根據本專利技術的脂肪細胞培養物相比，是否脂肪細胞代謝的至少一個代表性參數發生了改變；-如果化合物改變了脂肪細胞代謝的至少一個代表性參數，那么選擇該化合物。專利技術詳述如此處所意圖的，表述“成熟脂肪細胞”表示分化的脂肪細胞。本領域技術人員可以容易地鑒定成熟脂肪細胞。特別是，根據本專利技術的成熟脂肪細胞通常具有單一脂質液泡、脂解活性，特別是被β -腎上腺素能制劑(如腎上腺素和去甲腎上腺素)所誘導的、并且還對胰島素敏感，尤其定義為胰島素誘導的葡萄糖和脂肪酸從細胞外介質到細胞內介質的轉運，所述轉運尤其和，成熟脂肪細胞的質膜內，分別為GLUT-4和⑶36轉運蛋白的胰島素依賴性易位有關。根據本專利技術的成熟脂肪細胞尤其不同于前脂肪細胞，尤其是在本領域技術人員公知的前脂肪細胞特異性標志物DelKl/Prefl的表達方面(其可以通過實時PCR測量)，在根據本專利技術的成熟脂肪細胞中基本上不存在。根據本專利技術的成熟脂肪細胞分離自脂肪組織。因此，根據本專利技術的成熟脂肪細胞，尤其不來自脂肪細胞的前體(如前脂肪細胞或全能、多能或多潛能干細胞)的體外分化。至于根據本專利技術的脂肪組織，它可以來自任何動物物種。然而，優選根據本專利技術的脂肪組織取自一個或多個人類個體。可以通過本領域技術人員公知的眾多方法從脂肪組織分離成熟脂肪細胞，尤其是利用成熟脂肪細胞的低密度。特別是，可以用膠原酶處理脂肪組織，然后，消化之后，通過織造的棉紗布過濾；使濾出物在水介質中沉積，通過收獲懸浮的細胞可以回收根據本專利技術的成熟脂肪細胞的同質群。如此處所意圖的，“成熟脂肪細胞的同質群”特別是這樣的，其基本上不含其它細胞類型，特別是內皮細胞或前脂肪細胞。特別是，根據本專利技術的成熟脂肪細胞的同質群包括小于10%、更特別是小于5%的成熟脂肪細胞以外的細胞，特別是前脂肪細胞。例如，可以通過定量表達前脂肪細胞特異性標志物(如DelKl/Prefl)的細胞的數目來確定成熟脂肪細胞的同質群中前脂肪細胞的量。如此處所意圖的，“成熟脂肪細胞的單培養物”是成熟脂肪細胞的同質群的培養物。當其被孵育時，成熟脂肪細胞的同質群被說成是“培養的”或“在培養中”，即在允許構成群的細胞生存的條件下，保持在體外。這種條件還有適當的培養介質是本領域技術人員公知的。這些培養介質是這樣的，其包含能夠保證構成群的細胞生存至少12小時、優選至少24小時、更優選至少48小時的所有元素，特別是營養元素。通過舉例的方式，群可以孵育于DMEM/F12、1%青霉素-鏈霉素、50nM胰島素介質中，在攪拌下，在37°C下，在5%CO2氛圍中，介質定期更新。有利的是，用于根據本專利技術的成熟脂肪細胞的培養介質可以例如包括旨在調節成熟脂肪細胞代謝活性的化合物，如毛喉素和地塞米松。此外，成熟脂肪細胞的群的培養優選進行至少3小時、6小時、12小時、24小時或48小時。根據本專利技術的，當脂肪細胞接觸基質時，即當它們鋪于基質上時，或當它們附著在基質上時，成熟脂肪細胞“培養于三維培養基質上”。在一個具體的實施方式中，根據本專利技術的，包括以下步驟-使脂肪細胞的同質群接觸三維培養基質； -孵育接觸培養基質的成熟脂肪細胞，特別是在允許細胞存活特別是至少存活48小時的條件下。根據本專利技術，“三維培養基質”由材料，特別是適合用于獲得三維細胞培養物的生物相容材料組成；換言之，三維培養基質是合適的，特別是用于獲得幾個疊加的細胞層。因此，只允許培養二維細胞層，即單層細胞的培養基質不是根據本專利技術的三維培養基質。優選地，根據本專利技術的三維培養基質是水凝膠。更優選地，根據本專利技術的三維培養基質是由肽的非共價結合形成的水凝膠，所述肽包括10到30個殘基，如包括序列R-A-D-A的重復的肽，特別是序列 R-A-D-A-R-A-D-A-R-A-D-A-R-A-D-A (SEQ ID N0:11)。可以修飾形成水凝膠的肽，例如，通過向肽的N-端添加乙酰基以及通過在肽的C-端加入-NH2基團。因此，肽可本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：D·拉卡薩，V·佩萊格里內利，M·喬菲帕提，K·克萊芒，
申請(專利權)人：皮埃爾和瑪利居里大學巴黎第六大學，法國公立援助醫院，
類型：
國別省市：