涉及由多能干細胞向血細胞分化的培養方法技術

本發明專利技術的目的在于提供有效率的向血細胞進行分化的培養方法。具體而言，本發明專利技術通過在體外由ES細胞或iPS細胞等多能干細胞制備血細胞時在低氧分壓下進行培養，使向造血祖細胞或紅系祖細胞等分化的效率增大，使最終得到的所需血細胞的數目增大。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及用于向血細胞分化的細胞培養方法。更具體而言，本專利技術涉及使能夠向造血祖細胞進行分化的細胞分化成造血祖細胞、進而分化成血細胞的細胞培養法。
技術介紹
在治療血液相關疾病時，穩定地供給各種血細胞的必要量是非常重要的。迄今為止,主要由通過供體獻血而采集的血液來制備各種血細胞,用于手術等的治療。然而，由于慢性的供體不足，因此不容易在必要時迅速確保充分量的血細胞。特別是，血液凝固(止血)所必需的細胞即血小板雖然在白血病、骨髓移植、抗癌治療等中是必需的細胞，但是無法將從供體采集到的血小板進行冷凍保存，因此對用于穩定供給的有效方法的需求是極其高的。最近，也在積極進行在不依賴于來自供體的提供的情況下由ES細胞、iPS細胞等多能干細胞在生物體外制備各血細胞的嘗試，其實用化備受重視。例如，Takayama等報告了成功地從人ES細胞產生血小板的情況(專利文獻I及非專利文獻I)。此外，還公開了同樣地也可從iPS細胞制備血小板的情況(專利文獻2)。通過開發出在生物體外由多能干細胞制備血細胞的方法，從而今后的醫療現場中使用的各種血細胞中的大多數可由多能干細胞制備，從而產生對容易地解決慢性血細胞不足的期待。然而，迄今為止所報告的由iPS細胞或ES細胞制備血細胞的方法中，現狀是制得的血細胞的量少而難以確保手術等治療所認為必要的量。因此，應當利用某種方法促進向血細胞的分化，因此，有必要對現有方法進行改良。作為在進行細胞分化誘導時生物體內與生物體外存在很大不同的條件之一，可舉出氧濃度。已報告了在生物體外進行細胞分化誘導時在比大氣氧環境低的氧濃度下將各祖細胞進行培養等而進行分化誘導的幾個例子(非專利文獻2 非專利文獻5，專利文獻3 專利文獻5)。例如，迄今為止，報告了將能夠分化成軟骨的細胞在低氧條件下進行培養而進行軟骨分化的方法(專利文獻3)、將未分化中樞神經細胞(專利文獻4)或神經嵴干細胞(專利文獻5)在低氧條件下進行培養的方法、將ES細胞在低氧濃度下培養后在大氣氧濃度下培養而使之向心肌細胞分化的方法(非專利文獻5)等。然而，對于低氧濃度對向血細胞進行分化的影響，尚未存在被詳細報告的前例?，F有技術文獻專利文獻專利文獻1:TO2008/041370專利文獻2:W02009/122747專利文獻3:日本特開2003-125787專利文獻4:TO00/29550專利文獻5:W000/29549非專利文獻非專利文獻l:Takayama 等，Blood, 111:5298-53062008非專利文獻2:Kennedy 等，Blood, 109:2679-26872007非專利文獻3:Prado-Lopez 等，Stem Cells, 28:407-4182010非專利文獻4:Martin-Rendon 等，Stem Cells, 25:1003-10122010非專利文獻5:Bauwens 等，Biotechnol Bioeng.，90:452-461200
技術實現思路
本專利技術人等已經確立了由多能干細胞取得造血祖細胞、進而使之分化成各種血細胞的方法，但是利用該方法制得的血細胞的量少，處于作為用于治療等的量不能說是充分 的狀況。因此，本專利技術鑒于上述情況，以確立更大量且穩定地在體外制備血細胞的方法為目標，目的在于提供向造血祖細胞進行分化誘導的新型方法，以及提供由該方法制得的造血祖細胞及從該造血祖細胞分化誘導的各種血細胞。專利技術人等在由多能干細胞誘導造血祖細胞的工序中，在一定期間在低氧分壓下進行細胞培養，結果發現經誘導的造血祖細胞的數目比僅在大氣氧分壓下進行培養時增大，從而完成本專利技術。SP，本專利技術涉及以下(I) (16)。(I) 一種造血祖細胞或紅系祖細胞的制備方法，包括以下工序將能夠向造血祖細胞或紅系祖細胞進行分化的細胞在氧分壓上升的環境中進行細胞培養。(2)根據上述(I)所述的造血祖細胞或紅系祖細胞的制備方法，其中，所述氧分壓上升的環境是包括在低氧分壓下進行細胞培養的工序的環境。(3)根據上述(2)所述的造血祖細胞或紅系祖細胞的制備方法，其中，所述低氧分壓為O. I 10%。(4)根據上述(2)或(3)所述的造血祖細胞或紅系祖細胞的制備方法，其特征在于，所述低氧分壓是如下的氧分壓在該分壓下進行培養時，與在其它分壓下的培養相比，低氧應答性的基因表達。(5)根據上述(2) (4)中任一項所述的造血祖細胞或紅系祖細胞的制備方法，其中，在所述低氧分壓下由細胞培養開始進行一定期間的細胞培養后，在更高的氧分壓下進一步進行細胞培養。(6)根據上述(5)所述的造血祖細胞或紅系祖細胞的制備方法，其中，所述一定期間為4 10天。(7)根據上述(5)或(6)所述的造血祖細胞或紅系祖細胞的制備方法，其中，所述一定期間是到呈現KDR陽性、⑶34陽性、⑶43陽性的細胞出現為止。(8)根據上述(5) (7)中任一項所述的造血祖細胞或紅系祖細胞的制備方法，其特征在于，改變至所述更高的氧分壓下的時期是成為中內胚層誘導的指標的基因表達的時期、成為造血祖細胞誘導的指標的基因的表達開始的時期、成為分化增殖性細胞因子的指標的基因的表達開始的時期、或者成為血細胞誘導的指標的基因的表達開始的時期。(9)根據上述(5) (8)中任一項所述的造血祖細胞或紅系祖細胞的制備方法，其中，所述更高的氧分壓為1Γ30%的氧分壓。(10)根據上述(I) (9)中任一項所述的造血祖細胞或紅系祖細胞的制備方法，其中，能夠向所述造血祖細胞或紅系祖細胞進行分化的細胞為多能干細胞。(11)根據上述(I) (10)中任一項所述的造血祖細胞或紅系祖細胞的制備方法，其特征在于，所述造血祖細胞或紅系祖細胞是從網狀結構或擬胚體取得的。(12)根據上述(I) (11)中任一項所述的造血祖細胞或紅系祖細胞的制備方法，其特征在于，在進行所述細胞培養的培養基中不添加VEGF。(13) —種造血祖細胞或紅系祖細胞，是由上述(I) (12)中任一項所述的方法制得的。(14)一種血細胞，是將上述(13)所述的造血祖細胞或紅系祖細胞進一步培養而制得的。(15) 一種醫藥制劑，包含上述(14)所述的血細胞。( 16) 一種篩選促進或阻礙向造血祖細胞或紅系祖細胞進行分化的物質的方法，其特征在于，使用上述(I)所述的制備方法。根據本專利技術，與現有方法相比，可使被分化誘導的造血祖細胞、紅系祖細胞以及血細胞的數目增大。根據本專利技術，可縮短用于取得所需數目的造血祖細胞、紅系祖細胞或血細胞的培養期間。根據本專利技術，可在不使用以往為了有效率地誘導造血祖細胞而必需的VEGF的情況下制備造血祖細胞。根據本專利技術，可獲得血液分化能力高的造血祖細胞、紅系祖細胞。 附圖說明圖I為低氧分壓下的培養賦予血細胞分化的效果?？v軸為在培養后產生的血細胞數。(I)為在21%氧分壓下培養14天的結果，(2)為在5%氧分壓下培養7天后在21%氧分壓下培養7天的結果，(3)為在5%氧分壓下培養14天的結果。(I)、(2)及(3)的全部實驗是在存在20ng/ml的VEGF的條件下進行的。使用的細胞為iPS細胞(TkCB7_4株)。圖2表示低氧培養對向造血祖細胞(HPC;hematopoietic progenitor cell)的分化的效果。使用流式細胞儀來研究低氧培養對向HP本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：佐野進彌，江藤浩之，高山直也，中內啟光，
申請(專利權)人：國立大學法人東京大學，泰爾茂株式會社，
類型：
國別省市：