涉及減毒支原體的方法技術

本發明專利技術提供了一種鑒定或產生減毒支原體細菌的方法，所述細菌具有至少一種所列出的基因中的突變，以及所述細菌在用于誘導對支原體的防護性免疫的疫苗中的應用或檢測被所述細菌感染中的應用。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及減毒豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)的應用，例如,診斷樣品中減毒支原體的存在的方法以及篩選減毒支原體的方法。
技術介紹
豬肺炎支原體為豬支原體肺炎的病源因素(也稱為地方性肺炎(EP))。它是影響全世界豬生產的最常見的和具有經濟顯著性的呼吸道疾病之一。這種疾病通常會伴隨著繼發性感染，高發病率，低死亡率以及低飼料轉化率，這種疾病所造成的全 球經濟損失估計為約每年十億美元。在EP中，豬肺炎支原體細菌粘附到豬肺部上皮細胞的纖毛上，損害健康的正常纖毛，同時造成機會性生物進入呼吸道組織中從而引起疾病。一旦定植，豬肺炎支原體將引起豬的肺部病變。這種疾病是高度傳染性的，并且通常通過直接接觸感染的呼吸道分泌物傳播，例如打噴嚏或咳嗽時從鼻孔或嘴中噴出的液滴。目前存在幾種抵抗豬肺炎支原體的疫苗。其中大多數疫苗由約十個公司的22個被注冊為單價或二價/多價的疫苗商標所提供。所有的疫苗都是滅活或者失活的豬肺炎支原體制劑。全細胞滅活的豬肺炎支原體疫苗的例子包括RESPISURE 和STELLAMUNE (輝瑞)、SUVAXYN Μ. ΗΥ0 (富道)、HY0RESP (梅里亞)、M+PAC (先靈葆雅)和 P0RCILIS (英特威)。盡管一些疫苗可減輕EP的嚴重程度，但沒有任何一種可用的全細胞滅活或失活的疫苗能夠完全免除豬肺炎支原體的感染。作為W02010/132932 公開的相關申請(co-pending application),描述了一種溫度敏感的活的減毒豬肺炎支原體菌株。在2004年5月13日將該菌株表示為ts-19，并作為NM 04/41259保藏在布達佩斯條約國家計量研究院。當將該菌株作為疫苗時，能夠賦予接種疫苗的豬對豬肺炎支原體的防護性免疫。
技術實現思路
第一方面，提供了一種鑒定減毒支原體細菌的方法，該方法包括分析支原體細菌，以確定在至少一種編碼表I列出的蛋白的基因中或在表2-5中的任何一個或多個列出的核酸分子中突變的存在；其中，突變的存在表明所述支原體是減毒的。減毒疫苗通常具有很多優越性，因為他們攜帶天然形式的與致病因子(infectious agent)有關的所有免疫原決定簇(immunogenic determinants),并將其帶入宿主的免疫系統中，并且由于所述因子能夠在接種疫苗的宿主中增殖,因此,需要的免疫因子的量相對少。減毒的方法包括將毒性菌株多次傳代或暴露于放射線或化學藥品。據推測，這些方法在基因組中引入了突變，致使微生物毒性降低但仍能復制。這些方法的缺點在于，引入了在分子水平上無法表征的隨機突變。同樣，篩選減毒的方法，如有關溫度敏感性的篩選，常常是耗時的，會產生錯誤的結果，因為溫度敏感的菌株可能不是減毒的，并且減毒菌株不需要是溫度敏感的，以及需要大量的試驗和錯誤。另夕卜，減毒菌株也可能進行進一步的突變并恢復為毒性菌株(virulence)。一種替代策略為產生不可逆的基因限定的減毒支原體。然而到目前為止，尚未確定支原體減毒影響的基因。與減毒支原體的親本菌株(Parent strain)相比，本專利技術確定了在減毒支原體中的突變，并利用這方面的知識確定了應該突變哪些基因以提供減毒支原體。第一方面的方法能夠促進減毒支原體菌株的篩選，以及鑒定減毒菌株是否已經恢復為毒性菌株。第二方面，提供了一種產生減毒支原體的方法，該方法包括將支原體細菌的初始群體(initial population)置于減毒條件下，從而產生假定的減毒細菌群，并分析假定的減毒細菌群的單克隆，以確定在至少一種編碼表I列出的蛋白的基因中或在表2-5中的任何一個或多個列出的核酸分子中突變的存在，其中，突變的存在表明所述支原體是減毒的。 第三方面，提供了一種由第一方面的方法篩選的或由第二方面的方法產生的減毒支原體細菌。第四方面，提供了一種含有第三方面的減毒支原體細菌的免疫原性組合物。第五方面，提供了一種含有第四方面的免疫原性組合物的支原體疫苗。第六方面，提供了一種誘導對個體(subject)中的支原體引起的疾病的防護性免疫的方法，該方法包括用安全劑量(protective amount)的第三方面的減毒支原體、第四方面的免疫原性組合物或第五方面的疫苗對個體進行給藥?？蛇x擇的方面，提供了用于誘導對支原體引起的疾病的防護性免疫的第三方面的減毒支原體、第四方面的免疫原性組合物或第五方面的疫苗。進一步可選擇的方面，提供了第三方面的減毒支原體、第四方面的免疫原性組合物或第五方面的疫苗在制備用于預防由支原體引起的疾病的藥物中的應用。本專利技術的專利技術人確定了減毒豬肺炎支原體菌株(ts-19)(保藏在國家計量研究院，保藏號(accession number)為NM04/41259)的核酸序列，以及毒性菌株(通過NTG 突變(Mycoplasma hyopneumoniae isolate LKR, Lloyd&Etheridge(1981)J. Comp.Path. 91:77-83)從該毒性菌株中產生減毒菌株)的序列。利用序列比對和他們在本領域中的知識分析，本專利技術的專利技術人能夠確定某些他們認為和減毒有關的突變。本專利技術的專利技術人將這些突變作為豬肺炎支原體中和其它支原體中減毒的標記，并且這些突變可以用來篩選減毒支原體菌株。當利用引起隨機突變的減毒條件產生減毒支原體時，這特別適用。突變的篩選提供了一種簡單的確定支原體菌株是否為減毒的菌株的方法，因此適于配制成疫苗。第七方面，提供了一種確定動物是否被減毒或毒性支原體菌株感染的方法，該方法包括分析來自動物的含有支原體的樣品，以確定在至少一種編碼表I列出的蛋白的基因中或在表2-5中的任何一個或多個列出的核酸分子中突變的存在，其中，不存在突變表明所述動物被毒性支原體感染了。第八方面，提供了一種區分接種減毒支原體菌株的動物和感染支原體的動物的方法，該方法包括分析含有支原體的樣品，以確定在至少一種編碼表I列出的蛋白的基因中或在表2-5中的任何一個或多個列出的核酸分子中突變的存在；其中，樣品中突變的存在表明所述樣品來源的動物接種了減毒的支原體疫苗。豬肺炎支原體是在豬中引起地方性肺炎的高度傳染性和慢性的疾病。這種疾病是在世界范圍內流行的。第七方面和第八方面的方法使得能夠將已接種減毒菌株的豬和感染的豬或疫苗菌株已轉化為毒性菌株的豬區分開。第九方面，提供了一種試劑盒，該試劑盒包括對一種或多種編碼表I列出的蛋白的基因中的突變或者表2-5中的任何一個或多個列出的核酸分子中的突變具有特異性的引物或探針。第十方面，提供了一種試劑盒，該試劑盒包括對圖I中顯示的至少一種突變具有特異性的引物或探針。第九方面和第十方面的試劑盒可以用于第一、第七或第八方面的方法中。附圖說明圖IA-C顯示了與作為NC 007295. I保藏的M. hto J和M.hyo LKR菌株相比，Μ· hyo ts-19疫苗菌株(第一代(master)和P12)中突變的確切性質和位置。圖2A-D顯示了在標準圖形模式中基因組靶MHP2的高分辨率溶解曲線(HRM)圖。(A)Vaxsafe MHP 菌株、Vaxsafe MHP 的親本菌株和 M. hyo 的野外分離株(field isolatedstrain)的 HRM ； (本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：R·尤偉爾，Y·艾博斯艾爾奧斯塔，
申請(專利權)人：澳大利亞生物資源公司，
類型：
國別省市：