一種羅丹明B人工抗原及其制備方法和應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)屬于免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種羅丹明B人工抗原及其制備方法和應(yīng)用。由于羅丹明B分子結(jié)構(gòu)本身含有羧基，因此不需要另行引入活性基團(tuán)。本發(fā)明專利技術(shù)將羅丹明B分子直接以碳二亞胺為偶聯(lián)劑，在N-羥基琥珀酰亞胺存在的情況下與載體蛋白偶聯(lián)從而得到羅丹明B的人工抗原。由于在最大程度上保持了其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，因此將其免疫動(dòng)物后有助于提高抗體的質(zhì)量。整個(gè)方法簡(jiǎn)單易行，操作簡(jiǎn)便，人工抗原得率和純度高。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于免疫學(xué)檢測(cè)
，具體涉及一種羅丹明B人工抗原及其制備方法和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
羅丹明B (Rhodamine B)俗稱玫瑰紅，花粉紅，是一種鄰苯二酚類(lèi)的堿性熒光染料，由于其具有很好的熒光性質(zhì)，目前已廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測(cè)、有色玻璃、特色煙花爆竹和生物學(xué)染色等領(lǐng)域。羅丹明B的結(jié)構(gòu)如圖1所示。近些年來(lái)，實(shí)驗(yàn)研究表明:羅丹明B可以明顯減少人纖維原細(xì)胞的數(shù)量，抑制其增殖；同時(shí)，它還可以抑制人血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的增殖。另外，經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn):羅丹明B能引起皮下組織生肉瘤，具有潛在的致癌和致突變能力。歐美等國(guó)家和地區(qū)從1993年起明令禁止其在食品加工中使用。我國(guó)衛(wèi)生部也在2008年將其列入首批食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單之中。但是由于其價(jià)廉易得、色澤鮮亮持久等特點(diǎn)，仍然有一些不法食品生產(chǎn)、加工商違規(guī)、違法使用羅丹明染料。這一方面給國(guó)家的食品安全帶來(lái)了很大的隱患；另一方面，也給消費(fèi)者的身心健康帶來(lái)嚴(yán)重威脅。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)食品中羅丹明B的常用檢測(cè)方法是高效液相色譜法(HPLC)、高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)。但是由于色譜法的樣品前處理復(fù)雜繁瑣，需要精密昂貴的檢測(cè)器和質(zhì)譜等儀器設(shè)備，同時(shí)還要有專門(mén)的技術(shù)人員操作儀器，很難達(dá)到快速、便捷的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)要求，因此限制了其在許多檢測(cè)機(jī)構(gòu)尤其是基層檢測(cè)部門(mén)的大規(guī)模推廣使用。酶聯(lián)免疫檢測(cè)分析(Enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)由于具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)，近些年來(lái)備受人們的關(guān)注。免疫分析是以抗體作為生物檢測(cè)器的分析技術(shù)，而羅丹明B作為小分子物質(zhì)，分子量為479，是半抗原，本身不具有誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的能力，不能直接通過(guò)它免疫動(dòng)物而得到檢測(cè)所必須的抗體，因此，合成羅丹明B的人工抗原便成為建立其ELISA分析方法的首要步驟和關(guān)鍵所在。從羅丹明B分子結(jié)構(gòu)中可以看出:它本身含有羧基，因此不需要另行引入活性基團(tuán)。本專利技術(shù)將羅丹明B分子直接以碳二亞胺為偶聯(lián)劑，在N-羥基琥珀酰亞胺 存在的情況下與載體蛋白偶聯(lián)從而得到羅丹明B的人工抗原。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問(wèn)題是: 本專利技術(shù)主要是利用羅丹明B分子結(jié)構(gòu)本身含有的活性基團(tuán)一羧基，為羅丹明B提供了一種人工抗原及其制備方法和應(yīng)用。本專利技術(shù)的技術(shù)方案是: 本專利技術(shù)所述的羅丹明B人工抗原為載體蛋白直接與羅丹明B分子中的羧基通過(guò)脫水縮合形成酰胺鍵而得，其結(jié)構(gòu)如圖1。將羅丹明B以碳二亞胺為偶聯(lián)劑，在N-羥基琥珀酰亞胺存在的情況下與載體蛋白偶聯(lián)從而得到羅丹明B的人工抗原，其結(jié)構(gòu)如圖2。 羅丹明B人工抗原的合成:1、將羅丹明B96mg、N, N-二環(huán)己基碳二亞胺41.2mg、N_輕基琥拍酰亞胺46mg混合,溶解于400ul經(jīng)無(wú)水處理的N，N-二甲基甲酰胺中，室溫密封攪拌過(guò)夜； 2、將混合液IOOOrpm,離心5分鐘，后吸取上層反應(yīng)液,將其緩慢逐滴加入到冰浴的IOuM的BSA溶液中，4°C攪拌反應(yīng)過(guò)夜； 3、將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至透析袋中，以PBS為透析液4°C透析7天，每12小時(shí)換一次透析液，以除去未反應(yīng)的羅丹明B等雜質(zhì)； 4、透析結(jié)束后，將反應(yīng)液離心，7000rpm，離心5分鐘，得羅丹明B的人工抗原。羅丹明B人工抗原的合成路線見(jiàn)圖3。本專利技術(shù)與已有技術(shù)相比其有益效果是: 目前所報(bào)道的羅丹明B人工抗原的制備方法中，主要是通過(guò)對(duì)羅丹明B的類(lèi)似物一羅丹明123中的活性基團(tuán)氨基進(jìn)行修飾偶聯(lián)而來(lái)。雖然羅丹明123與羅丹明B的結(jié)構(gòu)相似，都具有苯環(huán)部分和羧基部分，但是與羅丹明B相比，羅丹明123結(jié)構(gòu)中苯環(huán)上所連接的是氨基，而不是兩個(gè)乙基，這樣就導(dǎo)致了其空間結(jié)構(gòu)在這一區(qū)域有著很大的不同；另一方面，由于羅丹明123結(jié)構(gòu)中帶有兩個(gè)氨基而直接引起了兩種物質(zhì)帶電情況具有很大的區(qū)另IJ，這兩方面的原因可能直接導(dǎo)致抗原決定簇的改變和抗原遞呈細(xì)胞對(duì)羅丹明B的識(shí)別和遞呈能力，最終導(dǎo)致產(chǎn)生的抗體具有很大的差異。本專利技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于我們根據(jù)羅丹明B自身帶有活性基團(tuán)這一特點(diǎn) ，不改變它的結(jié)構(gòu)，直接對(duì)其進(jìn)行與載體的偶聯(lián)反應(yīng)，從而最大程度上保持了結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，因此將其免疫動(dòng)物后有助于提高抗體的質(zhì)量。本專利技術(shù)所述羅丹明B人工抗原可用于酶聯(lián)免疫檢測(cè)分析。四附圖說(shuō)明 圖1羅丹明B結(jié)構(gòu)式 圖2羅丹明B人工抗原結(jié)構(gòu)式 圖3羅丹明B人工抗原的合成路線圖 圖4A羅丹明B與載體蛋白BSA偶聯(lián)物的紫外掃描圖譜 圖4B羅丹明B與載體蛋白OVA偶聯(lián)物的紫外掃描圖譜 五具體實(shí)施例方式 實(shí)施例1羅丹明B-BSA偶聯(lián)物 1、將羅丹明B96mg、N, N-二環(huán)己基碳二亞胺41.2mg、N_輕基琥拍酰亞胺46mg混合,溶解于400ul經(jīng)無(wú)水處理的N，N-二甲基甲酰胺中，室溫密封攪拌過(guò)夜； 2、將混合液IOOOrpm,離心5分鐘，后吸取上層反應(yīng)液,將其緩慢逐滴加入到冰浴的IOuM的BSA溶液中，4°C攪拌反應(yīng)過(guò)夜； 3、將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至透析袋中，以PBS為透析液4°C透析7天，每12小時(shí)換一次透析液，以除去未反應(yīng)的羅丹明B等雜質(zhì)； 4、透析結(jié)束后，將反應(yīng)液離心，7000rpm，離心5分鐘，得羅丹明B的人工抗原。實(shí)施例2羅丹明B-OVA偶聯(lián)物 1、將羅丹明B96mg、N, N-二環(huán)己基碳二亞胺41.2mg、N_輕基琥拍酰亞胺46mg混合,溶解于400ul經(jīng)無(wú)水處理的N，N-二甲基甲酰胺中，室溫密封攪拌過(guò)夜； 2、將混合液IOOOrpm,離心5分鐘,后吸取上層反應(yīng)液,將其緩慢逐滴加入到已經(jīng)冰浴的IOuM的OVA溶液中，4°C攪拌反應(yīng)過(guò)夜；3、將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至透析袋中，以PBS為透析液4°C透析7天，每12小時(shí)換一次透析液，以除去未反應(yīng)的羅丹明B等雜質(zhì)； 4、透析結(jié)束后，將反應(yīng)液離心，7000rpm，離心5分鐘，得羅丹明B的人工抗原。實(shí)施例3羅丹明B-BSA和羅丹明B-OVA偶聯(lián)物的鑒定 首先，采用紫外分光光度掃描的方法分別對(duì)羅丹明B-BSA (圖4A)和羅丹明B-OVA (圖4B)偶聯(lián)物進(jìn)行鑒定，根據(jù)其特征吸收峰的變化及其峰形鑒定是否偶聯(lián)成功。羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品在560nm處有一強(qiáng)的吸收峰，而B(niǎo)SA和OVA的最大吸收峰在280nm左右，但是偶聯(lián)物在這兩個(gè)波長(zhǎng)下均有吸收，這是由于兩種物質(zhì)偶聯(lián)后而引起的吸收峰疊加，表明兩者偶聯(lián)成功，計(jì)算得 出偶聯(lián)比約為1:6。本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種羅丹明B的人工抗原，其結(jié)構(gòu)為：其中，載體蛋白直接與羅丹明B分子中的羧基通過(guò)脫水縮合形成酰胺鍵而共價(jià)偶聯(lián)。FDA00002893038800011.jpg

【技術(shù)特征摘要】
1.一種羅丹明B的人工抗原，其結(jié)構(gòu)為:2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種羅丹明B人工抗原的合成方法，其特征在于合成步驟為: (1)將羅丹明B96mg、N,N- 二環(huán)己基碳二亞胺41.2mg、N-輕基琥拍酰亞胺46mg混合，溶解于400ul無(wú)水N，N- 二甲基甲酰胺中，室溫密封攪拌過(guò)夜； (2)將混合液離心，IOOOrpm,5分鐘，然后吸取上層反應(yīng)液，將其緩慢逐滴加入到冰浴的IOuM的BSA溶液中，4°C攪拌反應(yīng)過(guò)夜； (3)將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至透析袋中，以PBS為透析液4°C透析7天，每12小時(shí)換一次透析液，以除去未反應(yīng)的羅...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：沈萍萍，徐加發(fā)，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：南京大學(xué)，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：