一種利拉魯肽的全固相合成方法技術

本發明專利技術公開了一種利拉魯肽的全固相合成方法，以2-Cl-TrtResin為固相載體，以DIC/HOBt為縮合劑，經過微波反應技術的處理，縮短了反應時間，提高了縮合效率。側鏈修飾采用新穎ivDde側鏈保護的賴氨酸，進行側鏈修飾合成，期間采用20%哌啶脫Fmoc保護，直至直鏈多肽合成完畢。其次采用水合肼脫ivDde保護后，進行側鏈修飾反應。得到的在固相載體上的全保護利拉魯肽通過三氟醋酸的處理得到利拉魯肽粗品，并經過C18柱的純化凍干，得到純品利拉魯肽，經過強陰離子轉鹽并凍干后得到醋酸利拉魯肽醋酸鹽。本發明專利技術操作簡單，合成周期短，生產成本低，副產物少，產品收率高，利于大規模生產。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種多肽的合成方法，特別涉及。
技術介紹
利拉魯肽(Liraglutide)，是通過基因重組技術，利用酵母生產的人胰高糖素樣肽-1 (GLP-1)類似物，具有降低血糖、減輕體重、促進胰島細胞再生以及心血管系統保護等多種效應，臨床應用前景廣闊。現有的利拉魯肽生產方法及缺陷如下:1、基因工程法，由于利拉魯肽是一個具有支鏈修飾的非天然活性多肽，所以生產技術難度極大，設備要求高，大規模生產風險大，成本高，不利于工業化生產。2、固液合成法，需經過片段固相合成、全保護切割、全保護片段純化、片段縮合等幾個不同的階段，生產周期長。同時由于片段是全保護多肽，非常疏水，所以大大的增加了純化的難度。這就給大規模生產帶來了周期長，成本高的問題。3、CN102286092A的專利技術報道的Fmoc-Lys (Alloc)-OH方法，由于所采用的是先液相合成支鏈化合物(Palmitoyl-Glu-OtBu),同樣也需要進行反復純化的問題。選擇Fmoc-Lys (Alloc)-OH作為側鏈修飾用保護氨基酸的方法所帶來的弊端,在脫Alloc保護時對生產設備和生產環境帶來了更高的要求以及更長的生產周期，主要表現在以下幾個方面:1)由于脫Alloc保護基要用到的四三苯基膦鈀對空氣、光、熱等非常敏感，反應要求在無空氣、避光的條件下才能有效的進行。2)要求對保護肽樹脂在高真空的條件下40°C加熱干燥4小時。3)試劑四三苯基膦鈀價格昂貴，所需反應時間長(2小時)，并且需要在氬氣的保護下進行。4)由于反應是在封閉的狀態下進行，取樣困難，不利于中控，對大規模工業化生產帶來了很大的風險。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供，操作簡單，原材料成本低，合成周期短，后處理容易，副產物少，產品收率高等特點，利于利拉魯肽的大規模生產。本專利技術解決其技術問題所采用的技術方案是:，包括如下步驟:(I)以2-Cl-Tr樹脂為固相載體，與Fmoc-Gly-OH縮合反應獲得Fmoc-Gly-2-Cl-Trt 樹脂；(Fmoc-Gly-OH 的摩爾數:樹脂取代度=2:1)(2)通過固相合成法，按照利拉魯肽主鏈肽序依次縮合具有N端Fmoc保護且側鏈保護的氨基酸，其中賴氨酸采用Fmoc-Lys (ivDde)-0H,每次縮合反應30_35min后，再在微波條件下反應處理；(3)脫除賴氨酸側鏈保護基iv Dde ；(4)通過固相合成法，在賴氨酸側鏈偶聯Fmoc-Glu-OtBu，并在谷氨酸上連接棕櫚酸；(5)裂解，脫除保護基和樹脂得到利拉魯肽粗肽；(6)純化，凍干，轉鹽，凍干，得到利拉魯肽醋酸鹽。本專利技術線性肽(直鏈肽)部分采用特有的小配比(即縮合反應時，保護的氨基酸的摩爾數:樹脂取代度=2:1,而傳統的方法是3:1或者5:1,甚至高達10:1,反應時間I至2小時，甚至反應過夜。本專利技術的方法是保護的氨基酸的摩爾數:樹脂取代度=2:1，反應30-35分鐘再用微波照射15-20秒，反應即可完成)微波反應技術的Fmoc固相合成方法，以2-Cl-Trt Resin為固相載體，以DIC/HOBt為縮合劑。側鏈修飾采用新穎ivDde側鏈保護的賴氨酸。純化采用制備型反相高效液相色譜法以及本公司特 有的轉鹽技術。本專利技術提供的固相合成方法操作簡單，原材料成本低，合成周期短，后處理容易，副產物少，產品收率高等特點，利于利拉魯肽的大規模生產。本專利技術采用的小配比微波反應技術極大地提高了反應效率，提高了產品的純度。本專利技術采用的Fmoc-Lys (ivDde)-OH作為側鏈修飾的保護氨基酸可以在同一個反應器里無需做任何特殊的處理即可完成整個合成，而脫ivDde保護基的反應時間更是只需短短的幾分鐘即可完成。反應條件溫和。取樣方便，易于中控。同樣本專利技術采用了強陰離子轉鹽的工藝，對最終的產品用醋酸進行轉鹽，徹底清除了三氟醋酸對生物體的毒性。本方法操作簡單，合成周期短，生產成本低,副產物少,產品收率高,利于大規模生產。作為優選，步驟(2)中，縮合反應時，具有N端Fmoc保護且側鏈保護的氨基酸用量為:氨基酸的摩爾數:樹脂取代度=2:1 ;微波條件下反應具體為:微波輸出功率130w-195w，反應 15-20s。作為優選，步驟(3)采用水合肼溶液脫除ivDde，水合肼溶液用量為3_4倍樹脂體積，水合肼溶液體積配比為:水合肼:DMF=1:15-20。作為優選，步驟(6)所述轉鹽具體為:將50_60mg凍干的利拉魯肽粗肽溶解在6-7ml體積分數為0.1-0.2%的醋酸水溶液中，然后加入到250_300mg強陰離子樹脂中，磁力攪拌器上室溫下反應1-1.5小時，過濾，收集濾液，樹脂用l_2ml體積分數為0.1-0.2%醋酸水溶液洗滌2次，收集洗脫液，與濾液合并。本專利技術的有益效果是:操作簡單，原材料成本低，合成周期短，后處理容易，副產物少，產品收率高等特點，利于利拉魯肽的大規模生產。具體實施例方式下面通過具體實施例，對本專利技術的技術方案作進一步的具體說明。本專利技術中，若非特指，所采用的原料和設備等均可從市場購得或是本領域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領域的常規方法。實施例:下面以Ig 2-Cl-Trt樹脂為例，來具體說明本專利技術的操作流程。1、實驗原料2-Cl-Trt-resin、Fmoc-His(Trt)-OH>Fmoc-Asp(OtBu)-OH>Fmoc-Arg (pbf) -OH> Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Tyr (tBu) _0H、Fmoc-Ser(tBu)_0H、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-ValOH、Fmoc-Trp (Boc) OH、Fmoc-Glu(OtBu) _0H、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)rOH、Fmoc-Asp(OtBu) -OH、Fmoc-Gln(Trt)_0H、Fmoc-Lys(Dde) -OH、Fmoc-1le-OH、palmitic acid。2、實驗試劑N, N- 二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、N-羥基苯并三唑(HOBT)、苯并三氮唑-N，N, N’，N’-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)、哌啶、二氯甲烷(DIC)、無水乙醚、二異丙基乙胺(DIEA)、乙酸酐、Boc酸酐、水合肼、三氟乙酸(TFA)、1，2-乙二硫醇(EDT)、茴香硫醚、苯酹、卻三酮(5g/100ml)、苯酹(20g/150ml)、無水乙醇、甲醇、次氯酸鈉、超純水、無水CaCl2。試劑的配制脫保護試劑——哌啶:DMF=1:4(v/v)實驗前預先配好檢測試劑A—20g苯酚溶解于150ml無水乙醇中實驗前預先配好，棕色滴瓶，避光檢測試劑B—5g茚三酮溶解于IOOml無水乙醇中實驗前預先配好，棕色滴瓶，避光封頭試劑一甲醇:DIEA=1:1 (v/v )現用現配切割試劑——TFA =EDT:水:茴香硫醚:苯酚=87.5ml:2.5ml:5ml:5ml:5g現用現配3、操作規程(Ig樹脂)3.1樹脂的稱量及溶脹稱取Ig 2-Cl-Trt樹脂，加入至多肽合成反應器中，用量筒準確量取50ml DCM加入至反應器中，使樹脂完全浸沒在DCM溶劑中，與溶劑充分接觸，溶脹40min。3.2肽鏈的起始及延伸3本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種利拉魯肽的全固相合成方法，其特征在于：包括如下步驟：（1）以2?Cl?Trt樹脂為固相載體，與Fmoc?Gly?OH縮合反應獲得Fmoc?Gly?2?Cl?Trt樹脂；（2）通過固相合成法，按照利拉魯肽主鏈肽序依次縮合具有N端Fmoc保護且側鏈保護的氨基酸，其中賴氨酸采用Fmoc?Lys（ivDde)?OH，每次縮合反應30?35min后，再在微波條件下反應處理；（3）脫除賴氨酸側鏈保護基ivDde；（4）通過固相合成法，在賴氨酸側鏈偶聯Fmoc?Glu?OtBu，并在谷氨酸上連接棕櫚酸；（5）裂解，脫除保護基和樹脂得到利拉魯肽粗肽；（6）純化，凍干，轉鹽，凍干，得到利拉魯肽醋酸鹽。

【技術特征摘要】
1.一種利拉魯肽的全固相合成方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)以2-Cl-Trt樹脂為固相載體，與Fmoc-Gly-OH縮合反應獲得Fmoc-Gly-2-Cl-Trt樹脂； (2)通過固相合成法，按照利拉魯肽主鏈肽序依次縮合具有N端Fmoc保護且側鏈保護的氨基酸，其中賴氨酸采用Fmoc-Lys (ivDde)-0H,每次縮合反應30_35min后,再在微波條件下反應處理； (3)脫除賴氨酸側鏈保護基ivDde； (4)通過固相合成法，在賴氨酸側鏈偶聯Fmoc-Glu-OtBu，并在谷氨酸上連接棕櫚酸； (5)裂解，脫除保護基和樹脂得到利拉魯肽粗肽； (6)純化，凍干，轉鹽，凍干，得到利拉魯肽醋酸鹽。2.根據權利要求1所述的一種利拉魯肽的全固相合成方法，其特征在于:步驟(2)中，縮合反應時，具有...

【專利技術屬性】
技術研發人員：周耐明，
申請(專利權)人：寧波盛泰生物醫藥科技有限公司，
類型：發明
國別省市：