環化循環置換熒光蛋白及其制備方法和用途技術

本發明專利技術公開了一種環化循環置換熒光蛋白及其制備方法和用途，屬于生物技術。本發明專利技術由融合基因編碼表達，并迅速由蛋白內含子催化自發地環化而成，被相應的蛋白水解酶水解后產生熒光，因此可作為蛋白水解酶活性指示劑。這樣設計的本發明專利技術，以環化循環置換熒光蛋白為蛋白水解酶的底物，以反應后產生的熒光為指標，不需要破壞樣品，便可快速、準確地檢測樣品中的蛋白水解酶的活性，靈敏、直觀、便捷、省時。不僅可以實現實時監測細胞內蛋白水解酶的活性，還可方便地檢測體外蛋白水解酶的活性。由于熒光方法方便檢測和操作，因此，本發明專利技術中的環化循環置換熒光蛋白及其表達基因能制備成檢測水解蛋白酶活性的試劑，或試劑盒。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物技術，具體是一種環化循環置換熒光蛋白及其制備方法和用途。
技術介紹
在20世紀60年代分離自維多利亞多管水母的綠色突光蛋白(Greenfluorescent protein, GFP )以及經改造獲得的突變體構成的“GFP家族”蛋白得到飛速發展，逐步成為探索活體細胞合成代謝、分解代謝基本原理，了解各種酶的功能的重要手段，為深入研究及有效利用打下基礎。熒光蛋白應用主要包括:(1)基因轉錄或作為一種與目的基因結合的報告基因。熒光蛋白基因在N端或C端與異源基因接合夠成編碼融合蛋白的嵌合基因，其表達產物既保持了外源蛋白的生物活性，又表現出與天然熒光蛋白相似的熒光特性。熒光蛋白的這種特性為蛋白質提供了一種熒光標記，不僅可以用來在活體內追蹤某一特定蛋白的合成、運輸、和定位，還用于細胞器的動態觀察、有絲分裂的研究、細胞骨架的成分分析和細胞分泌過程觀察等，甚至也可以對某些DNA序列在活細胞的動態變化進行分析研究。與傳統抗體標記技術相比具有更高的靈敏度，簡化細胞固定、滲透壓調整、抗體培養等操作步驟，可用熒光顯微鏡直接進行觀察，而且熒光蛋白沒有毒性，在不同的生物中都能高水平表達且不影響其生理機能。(2)雙分子突光互補技術(Bimolecular fluorescencecomplementation, BiFC)。將突光蛋白在某些特定的位點切開，形成不發突光的N端與C端2個多肽，稱為N片段和C片段。這兩個片段在細胞內共表達或體外混合時，不能自發的組裝成完整的熒光蛋白，在該熒光蛋白的激發光激發時不能產生熒光。但當這兩個熒光蛋白的片段分別連接到一組相互作用的目標蛋白上，在細胞內共表達或體外混合這兩個融合蛋白時，由于目標蛋白質的相互作用，熒光蛋白的兩個片段在空間上相互靠近互補，重新構建成完整的具有活性的熒光蛋白分子，并在該熒光蛋白的激發光激發下，散發熒光。BiFC技術一經出現迅速得到廣泛應用，已經成功用于多種蛋白質的相互作用，如大腸桿菌、酵母細胞、絲狀真菌、哺乳動物細胞等。此技術的優點在于適用范圍廣泛，所研究的蛋白處于其天然的環境之中，能夠直觀的觀察蛋白質的相互作用，并且與應用廣泛研究體內蛋白質相互作用的酵母雙雜交技術相比耗時比較短。(3)突光共振能量轉換技術(FluorescenceResonance Energy Transfer,FRET)。當一個突光分子(如突光蛋白，作為供體)的發射譜與另一個熒光分子(作為受體)的吸收譜有重疊時，若這兩個熒光分子距離靠近，則會通過供體和受體之間電磁偶極相互作用發生非輻射的能量轉移。由于要發生能量轉移要求供體和受體之間的距離小于10納米，因此可用于研究分子的空間關系及相互作用。現已經發展了數十種不同吸收發射譜的熒光蛋白，已有許多實用的熒光蛋白組合，使得基于熒光蛋白的FRET成為應用最廣泛的熒光技術之一。而且隨著更多長波熒光蛋白的出現，發射譜在不斷拓寬，又發展出了多色熒光共振轉移技術進一步拓 展了該技術的應用。蛋白水解酶在體內廣泛存在，在調節生物學功能方面起著非常重要的作用。凋亡是細胞自然發生的過程，是細胞的程序性死亡，并受基因調控，是有機體發育與功能不可缺少的一部分，包括兩條主要途徑:外源性死亡受體途徑和內源性線粒體途徑。其中一類蛋白水解酶Caspase起著至關重要的作用。當細胞外環境發生致死性改變時，外源性的凋亡途徑被激活。存在于胞外的Fas> TNFa (Tumor Necrosis Factor)配體與其相應受體結合，凋亡信號由胞外結構域傳遞至胞內結構域，同時受體寡聚化，招募并結合輔因子FADD (Fas-Associated DeathDomain)、 TRADD (Tumor Necrosis Factor Receptor-1-Associated Death Domain),FADD、TRADD蛋白通過DED (Death Effector Domain,死亡效應域)與前體半胱氨酸蛋白酶Procaspase-8 (Cysteine Proteases)結合，此時形成 DISC (Death Inducing SignalingComplex,死亡誘導信號復合體)。結合的Procaspase-8通過自我剪切活化,一條途徑是剪切BID蛋白(Bcl2 Interacting Protein, Bcl_2相互作用蛋白),其羧基端部分轉位到線粒體，誘發CytoC (細胞色素C)的釋放。釋放的CytoC與APAFl (Apoptotic ProteaseActivating Factor-1,凋亡蛋白酶活化因子I)結合，同時結合dATP和Procaspase-9,并激活Caspase-9。活化的Caspase-9剪切Procaspase-3使其活化。另一條途徑就是活化的Caspase-8直接剪切Procaspase-3使其活化。活化的Caspase-3剪切DNA裂解因子ICAD(Inhibitor of Caspase-Activated Dnase,依賴 Caspase-激活的 DNA 酶抑制因子)，此因子以異源二聚體形式存在，包含CAD與剪切ICAD兩部分。剪切的ICAD與CAD分離，誘導具有DNA酶活性的CAD寡聚化。活化的CAD寡聚體進一步導致核小體間DNA的斷裂，染色質濃集，細胞最終走向凋亡。 細胞凋亡也可以通過內源性途徑誘導發生。細胞內源性應激損傷,如癌基因，DNA損傷，缺氧等均會導致線粒體膜通透性(Mitochondrial Membrane PermeabiIization)增力口。關于線粒體膜通透性的改變有兩種機制:一種是VDAC (Voltage-Dependent AnionChannel,電壓依賴性陰離子通道)，ANT (Adenine Nucleotide Transporter,腺嘌呤核苷酸轉運因子)，PBR (Peripheral-type Benzodiazepine Receptor,外周型苯二氮卓受體)和 CypD (Cyclophilin-D,親環蛋白 D)共同形成 PTPC (Permeability Transition PoreComplex,通透性轉換孔復合體)。此復合體可能與BAX(Bcl2 Associated X-protein,Bcl2相關蛋白X)，BAKl (Bcl2 Antagonist Killer-1, Bcl2蛋白拮抗劑-1)加速線粒體膜孔道開放有關。另外一種是BAX釋放并從細胞質轉位到線粒體中，在凋亡信號作用下寡聚化形成蛋白孔道。線粒體膜通透性增加導致CytoC釋放增多，最終導致Caspase-9的激活。活化的Caspase-9隨后剪切Caspase-3，引起下游通路中的一系列變化，導致細胞凋亡。由此可見，Caspases是細胞凋亡通路下游的關鍵蛋白水解酶，對其活性的監測能夠反映出細胞的生存狀態及細胞內外生理病理變化。
技術實現思路
本專利技術就是在已有熒光蛋白的基礎上，提供一種檢測蛋白水解酶的活性的環化循環置換熒光蛋白及其制備方法和用途。本專利技術是按照以下技術方案實現的。一種環化循環置換熒光蛋白，所述蛋白是環狀蛋白，由編碼融合循環置換熒光蛋白的基因表達，并迅速由其中的蛋白內含子催化自發環化而成本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種環化循環置換熒光蛋白，其特征在于：所述蛋白是環狀蛋白，由編碼融合循環置換熒光蛋白的基因表達，并迅速由其中的蛋白內含子催化自發環化而成，以熒光蛋白mVenus為模板的融合基因編碼表達的VPAI，含蛋白水解酶的識別位點DEVDG，經蛋白水解酶Caspase?3水解后產生黃色熒光，成為蛋白水解酶活性指示劑，VPAI的氨基酸序列如序列表中VPAI序列所示。

【技術特征摘要】
1.一種環化循環置換熒光蛋白，其特征在于:所述蛋白是環狀蛋白，由編碼融合循環置換熒光蛋白的基因表達，并迅速由其中的蛋白內含子催化自發環化而成，以熒光蛋白mVenus為模板的融合基因編碼表達的VPAI，含蛋白水解酶的識別位點DEVDG，經蛋白水解酶Caspase-3水解后產生黃色熒光，成為蛋白水解酶活性指示劑，VPAI的氨基酸序列如序列表中VPAI序列所示。2.根據權利要求1所述的環化循環置換熒光蛋白，其特征在于:以熒光蛋白Cerulean為模板的融合基因編碼表達的CPAI，含蛋白水解酶的識別位點DEVDG，經蛋白水解酶Caspase-3水解后產生青色熒光，成為蛋白水解酶活性指示劑，CPAI的氨基酸序列如序列表中CPAI序列所示。3.根據權利要求1所述的環化循環置換熒光蛋白，其特征在于:以熒光蛋白SfGFP為模板的融合基因編碼表達的GPAI，含蛋白水解酶的識別位點DEVDG，經蛋白水解酶Caspase-3水解后產生綠色熒光，成為蛋白水解酶活性指示劑，GPAI的氨基酸序列如序列表中GPAI序列所示。4.根據權利要求1所述的環化循環置換熒光蛋白，其特征在于:以熒光蛋白mCherry為模板的融合基因編碼表達的mCPAI，含蛋白水解酶的識別位點DEVDG，經蛋白水解酶Caspase-3水解后產生綠色熒光，成為蛋白水解酶活性指示劑，mCPAI的氨基酸序列如序列表中mCPAI序列所示。5.根據權利要求1所述環化循環置換熒光蛋白的制備方法，其特征在于: ①環化循環置換熒光蛋白基因表達質粒的構建， a.將線狀熒光蛋白游離的N端與C端縮短，保留熒光蛋白功能的序列， ...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李兵輝，張矯，
申請(專利權)人：天津醫科大學附屬腫瘤醫院，
類型：發明
國別省市：