鎮(zhèn)痛活性肽GRR兩個(gè)突變體及其制備與應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及利用基因工程技術(shù)獲得鎮(zhèn)痛活性肽GRR兩個(gè)突變體、鎮(zhèn)痛活性肽GRR兩個(gè)突變體衍生物、類似物、活性片段的結(jié)構(gòu)及其制備方法和鎮(zhèn)痛活性肽GRR兩個(gè)突變體及其衍生物、類似物、活性片段作為鎮(zhèn)痛藥物在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。所述的鎮(zhèn)痛活性肽GRR兩個(gè)突變體氨基酸序列如下：GRDAFIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。和GRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAGKFGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。所述的鎮(zhèn)痛活性肽GRR兩個(gè)突變體及其衍生物或類似物或活性片段可以與藥學(xué)上可接受的載體混合制備臨床上可接受的注射劑、口服制劑、透皮吸收制劑、粘膜吸收制劑等用于各類痛癥。本發(fā)明專利技術(shù)所述的鎮(zhèn)痛活性肽GRR兩個(gè)突變體具有較好的鎮(zhèn)痛活性，其獲得方法常規(guī)、簡(jiǎn)單、產(chǎn)量高。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及生物醫(yī)藥
，涉及鎮(zhèn)痛活性肽GRR兩個(gè)突變體及其獲得方法與應(yīng)用，具體地說(shuō)，本專利技術(shù)涉及鎮(zhèn)痛活性肽GRR兩個(gè)突變體及其衍生物、類似物、活性片段的結(jié)構(gòu)及其制備方法，以及作為鎮(zhèn)痛藥物在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
:在專利一鎮(zhèn)痛活性肽GRR及其制備與應(yīng)用(申請(qǐng)人:沈陽(yáng)藥科大學(xué)；專利技術(shù)人:張景海等；專利申請(qǐng)?zhí)?201010107462.5 ;申請(qǐng)公布號(hào):CN101880319 A)中并未提及其突變體的及其衍生物的研究，而利用生物技術(shù)發(fā)現(xiàn)并獲得了鎮(zhèn)痛活性肽GRR兩個(gè)突變體及其衍生物、類似物、活性片段是一項(xiàng)較新的技術(shù)，目前尚無(wú)人研究。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
: 本專利技術(shù)的目的是提供鎮(zhèn)痛活性肽GRR兩個(gè)突變體及其衍生物、類似物、活性片段以及其制備與應(yīng)用。具體是利用生物技術(shù)，在鎮(zhèn)痛活性肽GRR的基礎(chǔ)上篩選獲得鎮(zhèn)痛活性肽GRR兩個(gè)突變體及其衍生物、類似物、活性片段；鎮(zhèn)痛活性肽GRR兩個(gè)突變體的鎮(zhèn)痛生物活性較鎮(zhèn)痛活性肽GRR具有顯著提高的專利技術(shù)屬性。鎮(zhèn)痛活性肽GRR兩個(gè)突變體及其衍生物、類似物、活性片段獲得方法簡(jiǎn)單易行，可與任何載體混合制備醫(yī)學(xué)上可接受的劑型。本專利技術(shù)是利用生物技術(shù)或化學(xué)合成技術(shù)解決獲得方法，獲得仍具有鎮(zhèn)痛活性的鎮(zhèn)痛活性肽GRR兩個(gè)突變體及其衍生物、類似物、活性片段。本專利技術(shù)是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，它包括:針對(duì)鎮(zhèn)痛活性肽GRR的鎮(zhèn)痛活性，利用基因工程技術(shù)獲得一系列鎮(zhèn)痛活性肽GRR突變體及其部分片段或衍生物或類似物，通過(guò)獲得表達(dá)產(chǎn)物的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)鎮(zhèn)痛活性，以獲得可以進(jìn)一步開(kāi)發(fā)鎮(zhèn)痛類藥物的鎮(zhèn)痛活性肽GRR突變體及其部分片段或衍生物或類似物。本專利技術(shù)所述的獲得方法常規(guī)、簡(jiǎn)單、產(chǎn)量高，不僅具有重要的指導(dǎo)意義和實(shí)用價(jià)值，也為工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。本專利技術(shù)是針對(duì)鎮(zhèn)痛活性肽GRR突變體的鎮(zhèn)痛活性，利用基因工程技術(shù)獲得一系列鎮(zhèn)痛活性肽GRR突變體部分片段或衍生物或類似物，通過(guò)獲得表達(dá)產(chǎn)物的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)鎮(zhèn)痛活性，以獲得可以進(jìn)一步開(kāi)發(fā)鎮(zhèn)痛類藥物的鎮(zhèn)痛活性肽GRR突變體及其部分片段或衍生物或類似物。本專利技術(shù)提供多種鎮(zhèn)痛活性肽GRR突變體及其部分片段或衍生物或類似物的制備方法，它包括:利用基因工程技術(shù)進(jìn)行表達(dá)或通過(guò)化學(xué)合成獲得。基因工程技術(shù)方法包括: ⑴將鎮(zhèn)痛活性肽GRR突變體及其部分片段或衍生物或類似物的編碼DNA重組至表達(dá)載體； ⑵用步驟⑴的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞(原核或真核細(xì)胞)； ⑶在適合的誘導(dǎo)表達(dá)條件下，培養(yǎng)步驟⑵的被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞； ⑷收獲并純化所得到的表達(dá)產(chǎn)物。本專利技術(shù)提供上述鎮(zhèn)痛活性肽GRR突變體及其部分片段或衍生物或類似物的表達(dá)產(chǎn)物分離純化方法。 可使用鹽析沉淀、超濾、離子交換層析、疏水作用層析和凝膠過(guò)濾等方法，從細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物及培養(yǎng)液中分離并純化所需的表達(dá)產(chǎn)物。在表達(dá)產(chǎn)物的分離和純化過(guò)程中，可使用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)或蛋白免疫印跡法(WESTERN)檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的存在及相應(yīng)分子大小。本專利技術(shù)首次進(jìn)行上述鎮(zhèn)痛活性肽GRR突變體及其部分片段或衍生物或類似物的體內(nèi)鎮(zhèn)痛生物學(xué)活性實(shí)驗(yàn)。本專利技術(shù)還提供了上述鎮(zhèn)痛活性肽GRR突變體及其部分片段或衍生物或類似物在生物制藥領(lǐng)域的應(yīng)用，具體地說(shuō)是鎮(zhèn)痛生物活性。本專利技術(shù)的再一個(gè)目的是提供含有如上限定的蛋白質(zhì)及一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。可按照制藥工業(yè)領(lǐng)域已知的基本原則和方法制備適于胃腸道外途徑給藥的藥物組合物(如參見(jiàn)Remington’ s Pharmaceutical Science, 15th.,Mack Publishing Company, 1980)。可通過(guò)各種給藥途徑,特別是靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、腹腔內(nèi)、鼻內(nèi)、皮內(nèi)、皮下等胃腸道外途徑投用本專利技術(shù)的藥物組合物。本專利技術(shù)的另一個(gè)目的是提供如上限定的蛋白質(zhì)在生產(chǎn)鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。可使用本專利技術(shù)的蛋白或含有該蛋白質(zhì)的藥物組合物作為治療劑，用于治療特定類型人體的各種疼痛相關(guān)疾病。本專利技術(shù)的藥物組合物的治療有效劑量一般應(yīng)根據(jù)疾病的性質(zhì)、嚴(yán)重程度及對(duì)藥物的敏感適應(yīng)性，以及給藥途徑等諸多因素由臨床醫(yī)生按照個(gè)體化原則來(lái)確定。在本專利技術(shù)中，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞，常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。附圖說(shuō)明:圖1為鎮(zhèn)痛活性肽GRR突變體I氨基酸序列 圖2為鎮(zhèn)痛活性肽GRR突變體2氨基酸序列 具體實(shí)施方式: 下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本專利技術(shù)，而不是以任何方式限制本專利技術(shù)特批權(quán)利要求的范圍。實(shí)施例1: 鎮(zhèn)痛活性肽GRR突變體I基因的獲得 本實(shí)施例描述用于表達(dá)獲得本專利技術(shù)鎮(zhèn)痛活性`肽GRR突變體之一基因的構(gòu)建策略和基本方法。根據(jù)鎮(zhèn)痛活性肽GRR的氨基酸序列及其基因序列，針對(duì)第五位氨基酸殘基一Y(酪氨酸)，利用常規(guī)基因工程技術(shù)，以鎮(zhèn)痛活性肽GRR基因?yàn)槌霭l(fā)基因，將其轉(zhuǎn)換為F (苯丙氨酸)，從而獲得鎮(zhèn)痛活性肽GRR突變體I基因，該基因編碼的鎮(zhèn)痛活性肽GRR突變體I的結(jié)構(gòu)如下:GRDAFIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。實(shí)施例2: 鎮(zhèn)痛活性肽GRR突變體2基因的獲得 本實(shí)施例的策略、基本方法和基本過(guò)程同實(shí)施例1。根據(jù)鎮(zhèn)痛活性肽GRR的氨基酸序列及其基因序列，針對(duì)第四十二位氨基酸殘基一Y(酪氨酸)，利用常規(guī)基因工程技術(shù)，以鎮(zhèn)痛活性肽GRR基因?yàn)槌霭l(fā)基因，將其轉(zhuǎn)換為F (苯丙氨酸)，從而獲得鎮(zhèn)痛活性肽GRR突變體2基因，該基因編碼的鎮(zhèn)痛活性肽GRR突變體2的結(jié)構(gòu)如下:GRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAGKFGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。實(shí)施例3: 鎮(zhèn)痛活性肽GRR突變體I及其衍生物、類似物、活性片段的獲得 1.鎮(zhèn)痛活性肽GRR突變體I及其衍生物、類似物、活性片段基因的構(gòu)建 本實(shí)施例列舉描述用于表達(dá)本專利技術(shù)鎮(zhèn)痛活性肽GRR突變體I基因的構(gòu)建策略和基本方法。根據(jù)鎮(zhèn)痛活性肽GRR突變體I (結(jié)構(gòu)參見(jiàn)圖1.)的N末端和C末端氨基酸序列，分別設(shè)計(jì)相應(yīng)寡核苷酸引物，同時(shí)在上述兩個(gè)寡核苷酸引物的5'端，分別加上各自的限制性核酸內(nèi)切酶水解位點(diǎn)序列，以便基因重組的實(shí)施；以實(shí)施例1獲得的鎮(zhèn)痛活性肽GRR突變體I基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物并進(jìn)行核酸片段的凝膠回收；經(jīng)過(guò)上述提及的限制性核酸內(nèi)切酶雙酶切后與同樣進(jìn)行雙酶切的質(zhì)粒在T4 DNA Iigase的作用下進(jìn)行重組連接，熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH 5 α，經(jīng)過(guò)菌落PCR和限制性核酸內(nèi)切酶酶切驗(yàn)證篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子后提交生物技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定。結(jié)果表明，通過(guò)上述基因工程的方法成功構(gòu)建鎮(zhèn)痛活性肽GRR突變體I表達(dá)重組載體。同理，利用基因工程技術(shù)，可以分別獲得鎮(zhèn)痛活性肽GRR突變體I衍生物、類似物、活性片段基因。2.鎮(zhèn)痛活性肽GRR突變體I及其衍生物、類似物、活性片段的獲得 利用基因過(guò)程技術(shù)，將鎮(zhèn)痛活性肽GRR突變體I基因重組至大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒中，提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。該重組表達(dá)質(zhì)粒編碼表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征為GRDAFIAQNYNCVY本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
鎮(zhèn)痛活性肽GRR兩個(gè)突變體，其特征在于，它們具有如下氨基酸序列：?GRDAFIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAGKYGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR；GRDAYIAQNYNCVYHCFRDDYCNGLCTENGADSGYCYLAGKFGHACWCINLPDDKPIRIPGKCHRR。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張景海，鄧?yán)?/a>，崔勇，趙勇山，宋永波，趙明沂，劉巖峰，張嶸，吳春福，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：沈陽(yáng)藥科大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：遼寧;21