本發明專利技術涉及一種豬細小病毒VP2親和肽A和B及其編碼核苷酸，豬細小病毒VP2親和肽A，氨基酸序列如序列表SEQ?ID?No.1所示，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?No.2所示。豬細小病毒VP2親和肽B，氨基酸序列如序列表SEQ?ID?No.3所示，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?No.4所示。還涉及到一對引物VP2-3和VP2-4的核苷酸序列。本發明專利技術的多肽由于分子量較小，易穿透進入組織，比大蛋白滲透能力更強；半衰期短，在組織中蓄積很少；結構穩定且生產成本較低。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種豬細小病毒VP2親和肽及其編碼核苷酸，屬于生物
技術介紹
卩遼菌體表面展不技術(phagedisplay random peptide library)是20世紀80年代發展起來的利用噬菌體表達外源基因的一項分子生物學新技術。噬菌體展示技術所選用的噬菌體載體是絲狀噬菌體，包括Π，fd和M13噬菌體，其中M13噬菌體最為常用。這類單鏈環狀DNA病毒顆粒的噬菌體，編碼11種蛋白質，pII1、pV1、pVI1、pVII1、pIX為其衣殼結構蛋白，其中PVIII蛋白為主要衣殼蛋白，構成噬菌體的管狀結構，呈螺旋對稱排列，pill和PVII蛋白位于噬菌體外殼的尾端，是噬菌體吸附宿主菌的結構。目前大多數基于VP2的研究主要集中在PPV診斷和免疫方面；關于VP2在PPV感染過程中的作用機理研究方面的資料較少。目前豬細小病毒病在我國感染十分嚴重，陽性率可達90%以上，給養豬業造成了巨大的經濟損失。PPV VP2是構成衣殼蛋白的主要成分，其編碼的多肽能自我裝配成類病毒粒子，具有很強的免疫原性，是防治細小病毒病的主要蛋白。基于傳統疫苗的一些弊端，人工設計合成多肽疫苗將成為可能。噬菌體展示技術在新型疫苗研制上具有獨特的優勢，一是:噬菌體所展示的抗原表位能保持一定的空間構象，能有效刺激幾天產生免疫應答；二是:噬菌體本身既可以做為載體，又可作為良好的免疫佐劑，能增強免疫效果。同時，噬菌體展示肽庫技術對淘選PPV的抗原表位，研究豬細小病毒表面分子及其結合的受體，以及病毒侵入宿主細胞的分子機制，研制更有效的抗細小病毒的藥物具有重要意義。1985年，Smith第一次證實絲狀噬菌體fd基因組可以通過基因工程手段，將目的基因編碼的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌體表面。其基本原理為:選擇合適的噬菌體為載體，利用基因工程技術將 外源基因克隆到其載體上，同時將外源基因編碼的融合蛋白在噬菌體顆粒表面展示出來，被展示的多肽保持相對獨立的空間結構和生物活性，有利于受體的識別和結合，從而組成含有多種短肽的庫。外源蛋白或多肽的基因型和表現型的對應關系。噬菌體展示技術將基因表達與親和選擇相結合，其過程是將目的蛋白吸附于固相載體上，如酶標板或顆粒物質。原始肽庫噬菌體與靶分子短時間孵育，洗去未結合的噬菌體，然后用特定的洗脫液將與靶蛋白特異性結合的噬菌體洗脫下來。擴增洗脫后的噬菌體，然后進行下一輪淘選，經過3 4循環的“吸附-洗脫-擴增”后，最終得到高度富集與靶蛋白結合的序列，然后通過酶聯免疫吸附試驗進一步鑒定篩選，獲取真正的目的克隆，通過測定DNA序列，推導其氨基酸序列。最后合成多肽進一步研究其生物活性。
技術實現思路
本專利技術的目的在于通過噬菌體展示肽庫技術淘選PPV的抗原表位，提供一種豬細小病毒VP2親和肽A和B及其編碼核苷酸。本專利技術的目的通過下述技術方案實現:1、一種豬細小病毒VP2親和肽A，氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示。2、如上所述的一種豬細小病毒VP2親和肽A的核苷酸，核苷酸序列如序列表SEQID N0.2 所示。3、另外一種豬細小病毒VP2親和肽B，氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.3所示。4、如上所述的一種豬細小病毒VP2親和肽B的核苷酸，核苷酸序列如序列表SEQID N0.4 所示。5、一種VP2序列的的擴增引物VP2-3和VP2-4，核苷酸序列為:VP2-3:5’ -GGGGATCCATGAGTGAAAATGTGGAA-3’ ；VP2-4: 5，-CCCCGTCGACTTAGTATAATTTTCTTGG-3，。本研究相對于現有技術，有如下有點及有益效果:利用噬菌體隨機十二肽庫技術淘選出了與VP2蛋白特異性結合的多肽。人工合成此短肽，對防治豬細小病毒病提供了一定的理論基礎和試驗依據。在此基礎上我們擬利用病毒學實驗技術分析并特性鑒定的多肽在細小病毒感染周期中的作用，為PPV感染和致病機理的研究提供重要理論依據，也為尋找PPV VP2抗原表位及病毒侵入細胞機制提供了重要的理論依據。本專利技術的多肽由于分子量較小，易穿透進入組織，比大蛋白滲透能力更強；半衰期短，在組織中蓄積很少(減少其代謝物引起并發癥的風險)；結構穩定且生產成本較低。附圖說明圖1是VP2基因的PCR擴增結果；其中M是Marker，I是VP2 基因的擴增片段，2是陰性對照；圖2是pET32a_VP2重組表達載體的PCR鑒定結果，I是VP2基因的擴增片段；圖3是pET32a_VP2重組表達載體的雙酶切鑒定結果，I是BamH I和Sal I雙酶切結果;圖4是VP2融合蛋白的SDS-PAGE電泳圖；其中M:低蛋白質標準分子量；1:空載體菌液；2:未誘導菌液；3 1:誘導I 5h的重組菌；8:超聲破碎后菌體沉淀；9:菌體上清；圖5是噬菌體結合克隆模板DNA的純化結果；其中M:DL8000DNA Marker ; I 10:分別對應I 10噬菌體結合克隆模板DNA的純化；圖6是噬菌體PCR純化產物圖；其中M:DL8000DNA Marker ;1 10:分別對應I 10噬菌體PCR擴增產物；圖7是噬菌體結合克隆的ELISA檢測結果(0D490)；圖8是MTT法體外檢測多肽抑制效果，A為多肽對PPV抑制的MTT結果，B為多肽對PPV感染細胞的抑制率；圖9是間接免疫熒光體外檢測多肽抑制效果，ST細胞對照(A)，100TCID50PPV對照(B)，I 號肽 +PPV (C)，2 號肽 +PPV (D)，1+2 號肽 +PPV (E、F)；具體實施例方式本專利技術設計一對引物，擴增得到PPV VP2基因片段，構建重組質粒VP2_pET32a經IPTG誘導，在E.coli Rosetta中進行高效表達。以VP2蛋白為靶分子，利用噬菌體隨即十二肽庫，對VP2重組蛋白進行了五輪生物淘選，最終篩選出6種親和力的十二肽。將親和力最高和重復性最好的2個序列合成十二肽，通過MTT法和免疫熒光試驗檢測合成肽體外抗病毒活性良好。本研究結果為尋找PPV受體奠定了基礎，為今后對PPV的防治及多肽疫苗的研制開發提供了一定的理論基礎和試驗依據。 實施例一 重組表達質粒pET32a_VP2的構建 (I) VP2序列的擴增(a)根據細菌偏愛的密碼子，設計引物VP2-3和VP2-4VP2-3:5’ -GGGGATCCATGAGTGAAAATGTGGAA-3，(劃橫線處表示引入的酶切位點為BamHI)VP2-4:5’ -CCCCGTCGACTTAGTATAATTTTCTTGG-3’ (劃橫線處表示引入的酶切位點為 Sail)(b)進行常規鏈式聚合酶反應擴增VP2基因以VP2-3和VP2-4為引物，以VP2-T-6為模板，以ExTaq聚合酶進行PCR，VP2的PCR反應條件:50iil體系中含有所述PCR反應體系為50 ii L，包括5 ii LlOXEasyTaq Buffer、4u L dNTP、I u L VP2-3、I u L VP2_4、0.5u L VP2-T_6、0.5u L ExTaq聚合酶，加無菌水補至50 u L0將混合液在所述的PCR檢測的反應程序為:95°C預變性5min ;94°C變性Imin ；56°C退火Imin ;72°C延伸2min ;反應進行30個循環；最后本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種豬細小病毒VP2親和肽A，其特征在于，氨基酸序列如序列表SEQ?ID?No.1所示。
【技術特征摘要】
1.一種豬細小病毒VP2親和肽A，其特征在于，氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示。2.一種編碼如權利要求1所述的一種豬細小病毒VP2親和肽A的核苷酸，其特征在于，核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示。3.一種豬細小病毒VP2親和肽B，其特征在于:氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.3所/Jn o4.一種編碼如權利要求3所述...
【專利技術屬性】
技術研發人員：任曉峰，朱衛娟，斯琴高娃，任玉東，李廣興，
申請(專利權)人：東北農業大學，
類型：發明
國別省市：
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