本發明專利技術公開了一種豬圓環病毒2型滅活疫苗連續收毒懸浮培養生產方法，首先篩選出PCV2增殖敏感的細胞，擴大培養后消化細胞，接種到一級生物反應器，MEM細胞生長液培養后排出生長液，補加MEM細胞維持液，培養后排出維持液，細胞消化、分散后轉入二級生物反應器中培養，收獲細胞生長液和細胞維持液，細胞消化、分散后再轉入三級生物反應器中培養，收獲細胞生長液和細胞維持液，繼續在三級生物反應器中用細胞生長液和細胞維持液交替培養，收獲細胞生長液和細胞維持液至12代。PCV2增殖敏感的細胞適宜微載體連續多代次收獲抗原培養；生物反應器生產效率高、成本低；本發明專利技術的維持液抗原效價較傳統轉瓶的抗原效價提高10-20倍。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術的實施方式涉及獸用生物制品
，更具體地，本專利技術的實施方式涉 及一種適合豬圓環病毒2型懸浮培養的敏感細胞株篩選，使用該敏感細胞進行豬圓環病毒 連續收毒懸浮培養生產。
技術介紹
目前，關于豬圓環病毒2型滅活疫苗的生產基本都用豬源PK-15細胞采用傳統轉 瓶工藝實現。但轉瓶培養過程中，細胞增殖緩慢且生產過程中對細胞和病毒的培養條件， 如PH、溶氧、糖耗等難以監控和及時補給，無法提供最佳培養條件，造成該方法自動化程度 低，勞動強度大，并因轉瓶細胞培養環境不可控性，導致產品質量穩定性差，批間差較大。而 物學特性特殊，在細胞中增殖滴度低且不產生細胞病變，這與當前動物疫苗大規模 生產不相適應。此外，如要擴大該疫苗生產規模只能通過增加轉瓶數量的方法，結果導致車 間生產所需設備、人員等需求更大。另外，提高病毒效價，保證疫苗良好的臨床效果是解決 豬圓環疫苗2型滅活疫苗產業化的當務之急。 傳統工藝難以滿足豬圓環病毒2型滅活疫苗的生產需求，已有的豬圓環病毒2性 懸浮培養生產工藝，病毒效價雖有所提高，但收毒代次較少，生產成本較高，與傳統工藝比 較優勢并不顯著。
技術實現思路
本專利技術克服了現有技術的不足，提供一種豬圓環病毒2型滅活疫苗連續收毒懸浮 培養生產方法，涉及豬圓環病毒2型敏感細胞株的篩選，實現豬圓環病毒連續收毒懸浮培 養。 為解決上述的技術問題，本專利技術的一種實施方式采用以下技術方案： 一種，它包括以下步驟： (1)準備PK15克隆細胞 用PK-15細胞克隆得到PK15克隆細胞備用，該PK15克隆細胞的分類命名為豬 腎上皮細胞PK15,該細胞在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為 CGMCC N0:11198 ； (2)PCV2增殖敏感細胞篩選 消化不同的PK-15克隆細胞和母細胞并同步接種相同劑量的PCV2病毒，待細胞長 滿至少50 %時更換細胞維持液為MEM細胞維持液，37°C培養2d，用間接免疫熒光試驗檢測 病毒感染的細胞量，篩選出PCV#|殖敏感的細胞，然后置37°C恒溫箱連傳3代進行種細胞 擴繁，細胞長滿后加入適量細胞凍存液，于液氮凍存； (3)?(^2增殖敏感細胞增殖 將凍存的PCV#|殖敏感細胞在T25細胞瓶中進行復蘇，待細胞長滿單層后，以胰 酶-EDTA消化，以含8%新生牛血清的MEM細胞生長液傳代培養，按1:4至1:6傳代比例逐 級傳代放大至15L轉瓶內培養，按1:4至1:5傳代比例在15L轉瓶中擴傳； (4)PCV2懸浮培養及帶毒傳代 消化所述15L轉瓶中生長良好的PCV2增殖敏感細胞，按終濃度6-8X 10 5cells/ ml的接種密度接種預處理好的含微載體的16L -級生物反應器，培養體積不小于8L，以 含5-10 %新生牛血清的MEM細胞生長液培養細胞，在接種細胞時按0. 2%終體積同步接種 PCV2種毒，細胞與種毒接種后，一級生物反應器中培養的帶毒細胞標記為F1代；待細胞長 滿至少80%時停止攪拌，沉淀承載細胞的微載體，排出F1代細胞生長液，補加預熱至室溫 的MEM細胞維持液，培養48h，沉淀微載體與細胞，排出F1代細胞維持液；以胰酶-EDTA消 化微載體上的細胞，以含8 %新生牛血清MEM細胞生長液終止消化并分散細胞，將細胞轉至 預處理好的含微載體的二級生物反應器培養； 二級生物反應器的體積至少為一級生物反應器的2倍，培養體積不小于二級生物 反應器體積的1/2,二級生物反應器中的帶毒細胞標記為F2代；待二級生物反應器中細胞 長滿至少80%時停止攪拌，沉淀承載細胞的微載體，收獲F2代細胞生長液，補加預熱至室 溫的MEM細胞維持液，培養48h，沉淀微載體與細胞，收獲F2代細胞維持液；以胰酶-EDTA消 化微載體上的細胞，以含8 %新生牛血清MEM細胞生長液終止消化并分散細胞，將細胞轉至 預處理好的含微載體的三級生物反應器培養； 三級生物反應器為的體積至少為二級生物反應器的2倍，培養體積不小于三級生 物反應器體積的1/2,三級生物反應器中的帶毒細胞標記為F3代；待三級生物反應器中細 胞長滿至少80 %時停止攪拌，沉淀承載細胞的微載體，收獲F3代細胞生長液，補加預熱至 室溫的MEM細胞維持液，培養48h，沉淀微載體與細胞，收獲F3代細胞維持液； (5)帶毒細胞懸浮培養與連續收毒 (5. 1)帶毒細胞生長液培養 三級生物反應器中培養的帶毒細胞，收獲F3代細胞維持液后，加入預熱至室溫的 含5-10 %新生牛血清的MEM細胞生長液，帶毒細胞標記為F4代；生長液培養24h后，沉淀 微載體與細胞，收獲F4代細胞生長液； (5. 2)帶毒細胞維持液培養 三級生物反應器中的帶毒細胞，收獲F4代細胞生長液后，加入預熱至室溫的MEM 細胞維持液，培養48h，沉淀微載體與細胞，收獲F4代細胞維持液； (5. 3)帶毒細胞連續收毒 收獲F4代細胞維持液后，重復步驟（5. 1)的操作，以生長液培養帶毒細胞24h后， 收獲F5代細胞生長液；重復步驟（5. 2)的操作，以維持液培養帶毒細胞48h后，收獲F5代 細胞維持液；重復上述步驟，連續收毒至F12代以上，每個代次取樣觀察細胞狀態； (6)卩(^2抗原液檢測 對收獲不同代次的生長液與維持液分別進行無菌檢驗與？(^2病毒含量測定。 優選的方案是：所述一級生物反應器的培養體積為10L ;二級生物反應器的體積 為85L，培養體積為50L ;三級生物反應器的體積為500L，培養體積為300L。 進一步的技術方案是：所述步驟（1)的具體操作方法如下：將復蘇的PK-15細胞 培養成單層后用胰酶-EDTA消化，再加入適量含10%小牛血清的MEM細胞生長液吹打使細 胞分散成單個，然后進行10倍梯度稀釋至10-20cellS/mL，將稀釋好的細胞按照200 μ L/孔 鋪于96孔細胞培養板，于37°C、5% C02條件下培養9~lld，選取單個克隆進行擴大培養。 更進一步的技術方案是：所述胰酶-EDTA中胰酶的質量分數為0. 25%。 更進一步的技術方案是：所述一級生物反應器、二級生物反應器和三級生物反應 器中的微載體為cytodex-Ι微載體，使用濃度為3~5g/L。 更進一步的技術方案是：所述MEM細胞維持液為含2 %新生牛血清和1 % D-氨基 葡萄糖的細胞維持液。 更進一步的技術方案是：所述預處理是指將一級生物反應器、二級生物反應器或 三級生物反應器連接好各種管道、補料和輔助罐，接上T、pH、D0電極，進行電極的校正，培 養參數的設置，所述預處理還包括微載體的浸泡和滅菌；三種生物反應器的培養參數都為 PH 值 7. 0-7. 4, D0 為 20-30,溫度為 37°C，攪拌轉速為 18-25rpm。 更進一步的技術方案是：所當前第1頁1 2 3 4 本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種豬圓環病毒2型滅活疫苗連續收毒懸浮培養生產方法，其特征在于它包括以下步驟：(1)準備PK15克隆細胞用PK?15細胞克隆得到PK15克隆細胞備用，該PK15克隆細胞的分類命名為豬腎上皮細胞PK15，該細胞在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC?NO:11198；(2)PCV2增殖敏感細胞篩選消化不同的PK?15克隆細胞和母細胞并同步接種相同劑量的PCV2病毒，待細胞長滿至少50％時更換細胞維持液為MEM細胞維持液，37℃培養2d，用間接免疫熒光試驗檢測病毒感染的細胞量，篩選出PCV2增殖敏感的細胞，然后置37℃恒溫箱連傳3代進行種細胞擴繁，細胞長滿后加入適量細胞凍存液，于液氮凍存；(3)PCV2增殖敏感細胞增殖將凍存的PCV2增殖敏感細胞在T25細胞瓶中進行復蘇，待細胞長滿單層后，以胰酶?EDTA消化，以含8％新生牛血清的MEM細胞生長液傳代培養，按1:4至1:6傳代比例逐級傳代放大至15L轉瓶內培養，按1:4至1:5傳代比例在15L轉瓶中擴傳；(4)PCV2懸浮培養及帶毒傳代消化所述15L轉瓶中生長良好的PCV2增殖敏感細胞，按終濃度6?8×105cells/ml的接種密度接種預處理好的含微載體的16L一級生物反應器，培養體積不小于8L，以含5?10％新生牛血清的MEM細胞生長液培養細胞，在接種細胞時按0.2％終體積同步接種PCV2種毒，細胞與種毒接種后，一級生物反應器中培養的帶毒細胞標記為F1代；待細胞長滿至少80％時停止攪拌，沉淀承載細胞的微載體，排出F1代細胞生長液，補加預熱至室溫的MEM細胞維持液，培養48h，沉淀微載體與細胞，排出F1代細胞維持液；以胰酶?EDTA消化微載體上的細胞，以含8％新生牛血清MEM細胞生長液終止消化并分散細胞，將細胞轉至預處理好的含微載體的二級生物反應器培養；二級生物反應器的體積至少為一級生物反應器的2倍，培養體積不小于二級生物反應器體積的1/2，二級生物反應器中的帶毒細胞標記為F2代；待二級生物反應器中細胞長滿至少80％時停止攪拌，沉淀承載細胞的微載體，收獲F2代細胞生長液，補加預熱至室溫的MEM細胞維持液，培養48h，沉淀微載體與細胞，收獲F2代細胞維持液；以胰酶?EDTA消化微載體上的細胞，以含8％新生牛血清MEM細胞生長液終止消化并分散細胞，將細胞轉至預處理好的含微載體的三級生物反應器培養；三級生物反應器為的體積至少為二級生物反應器的2倍，培養體積不小于三級生物反應器體積的1/2，三級生物反應器中的帶毒細胞標記為F3代；待三級生物反應器中細胞長滿至少80％時停止攪拌，沉淀承載細胞的微載體，收獲F3代細胞生長液，補加預熱至室溫的MEM細胞維持液，培養48h，沉淀微載體與細胞，收獲F3代細胞維持液；(5)帶毒細胞懸浮培養與連續收毒(5.1)帶毒細胞生長液培養三級生物反應器中培養的帶毒細胞，收獲F3代細胞維持液后，加入預熱至室溫的含5?10％新生牛血清的MEM細胞生長液，帶毒細胞標記為F4代；生長液培養24h后，沉淀微載體與細胞，收獲F4代細胞生長液；(5.2)帶毒細胞維持液培養三級生物反應器中的帶毒細胞，收獲F4代細胞生長液后，加入預熱至室溫的MEM細胞維持液，培養48h，沉淀微載體與細胞，收獲F4代細胞維持液；(5.3)帶毒細胞連續收毒收獲F4代細胞維持液后，重復步驟(5.1)的操作，以生長液培養帶毒細胞24h后，收獲F5代細胞生長液；重復步驟(5.2)的操作，以維持液培養帶毒細胞48h后，收獲F5代細胞維持液；重復上述步驟，連續收毒至F12代以上，每個代次取樣觀察細胞狀態；(6)PCV2抗原液檢測對收獲不同代次的生長液與維持液分別進行無菌檢驗與PCV2病毒含量測定。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：高鵬，林艷，舒經香，
申請(專利權)人：成都天邦生物制品有限公司，
類型：發明
國別省市：四川;51
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