本發明專利技術公開了一種與乳腺癌腦轉移細胞特異性結合的BrBP1多肽，本發明專利技術還涉及制備該多肽的方法，包括采用噬菌體展示技術，進行多輪全細胞消減篩選，篩選出與乳腺癌腦轉移細胞系結合的噬菌體克隆；隨機挑出若干個噬菌體克隆，通過細胞ELISA方法選擇強陽性噬菌體克隆；將強陽性噬菌體克隆擴增后進行測序，將測得的BrBP1多肽通過人工方式合成。本發明專利技術還涉及該多肽在制備用于治療乳腺癌腦轉移藥物、用于乳腺癌腦轉移早期診斷的試劑盒上的應用。該多肽可通過人工方法合成，分子量小、活性高、穿透力強、親和力高、特異性高、毒性低，在體內體外都具有良好的腫瘤靶向性，還可內化進入細胞，適合作為靶向治療的載體。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種用于治療腫瘤的多肽，特別是一種與乳腺癌腦轉移細胞特異性結合的多肽，本專利技術還涉及制備該多肽的方法，以及該多肽在制備治療乳腺癌腦轉移藥物、制備用于乳腺癌腦轉移早期診斷試劑盒上的應用。
技術介紹
乳腺癌是一種嚴重危害女性健康的惡性腫瘤。全球乳腺癌患病率和死亡率均居女性惡性腫瘤首位，占所有女性癌癥病例數的23%和癌癥死亡數的14%。乳腺癌發展到晚期的典型表現是遠處擴散轉移，主要轉移到骨骼和腦等部位。其中，乳腺癌腦轉移的發生率占轉移病例的10%-16%。近年來，隨著患者生存期的延長和影像診斷技術的發展，乳腺癌腦轉移的檢出率逐年提高。但是，現有的藥物不能有效控制和治療乳腺癌腦轉移。近年來，抗體藥物治療腫瘤受到廣泛的關注，在治療乳腺癌方面，單克隆抗體類藥物一赫賽汀，對Her-2陽性的轉移性乳腺癌有較好的療效。對于Her-2陽性的乳腺癌患者，放療聯合赫賽汀治療是標準治療方法。但是，在診斷出遠處轉移灶前使用赫賽汀非但不能有效抑制腦轉移發生，還 會使腦轉移的相對危險度提高1.57倍。據報道，在診斷出乳腺癌腦轉移之后，50%的患者對化療敏感，轉移癥狀穩定，但是有一半患者死于進行性腦轉移。赫賽汀在腦部有效性較差可能由于赫賽汀對血腦屏障滲透性較低。在腦脊液中赫賽汀的水平僅是注射劑量的1/420，放療后濃度增加到1/49-1/76，但仍然不能達到有效治療水平。多肽藥物分子量小、活性高、穿透力強、親和力高、特異性高、毒性低，可以克服上述抗體治療中存在的問題，目前還沒有靶向治療乳腺癌腦轉移的多肽類藥物。因此，發現能與乳腺癌腦轉移細胞特異性結合的多肽，對乳腺癌腦轉移的早期診斷和有效治療具有極其重要的應用價值。專利CN101068935A公開了新的人基因B1194，A2282V1，A2282V2和A2282V3，它們的表達在乳腺癌中顯著增加，這些基因及其編碼的多肽可用于例如診斷乳腺癌，并作為開發抗乳腺癌藥物的靶分子。專利CN101334411A公開了作用于治療CXCR4受體介導的乳腺癌的多肽藥物的篩選、修飾方法、標記及其應用。兩篇專利文獻雖然都是與治療乳腺癌有關的多肽，但都未提及能和乳腺癌腦轉移細胞特異性結合。
技術實現思路
專利技術目的:
技術介紹
中提到雖然有專利文獻涉及與治療乳腺癌有關的多肽，但未提及能和乳腺癌腦轉移細胞特異性結合的多肽，本專利技術的目的在于提供一種能與乳腺癌腦轉移細胞特異性結合，還具有良好的腫瘤靶向性、可內化進入細胞的多肽。本專利技術的另一個目的在于提供制備與乳腺癌腦轉移細胞特異性結合的多肽的方法。本專利技術的另一個目的是提供上述多肽在制備用于治療乳腺癌藥物的應用。本專利技術的另一個目的是提供上述多肽在制備用于乳腺癌腦轉移早期診斷的試劑盒的應用。技術方案:本專利技術的目的是通過如下技術方案來實現的。本專利技術制備與乳腺癌腦轉移細胞特異性結合的多肽，利用噬菌體展示技術，以乳腺癌腦轉移細胞系MDA-231BR作為正篩細胞，以乳腺癌親代細胞系MDA-231P作為負篩細胞，進行多輪全細胞消減篩選，篩選出與乳腺癌腦轉移細胞特異性結合的噬菌體克隆。噬菌體單克隆化后通過細胞ELISA初步鑒定120個噬菌體克隆與細胞結合特性，選取P/N值大于3的強陽性克隆進行測序，成功測序的22個噬菌體克隆共發現3種序列，將其中占有絕對優勢的噬菌體克隆的氨基酸序列命名為BrBPl，經測序，其基因序列如SEQIDNO:1所示，將所測的BrBPl序列經過人工合成方法得到與乳腺癌腦轉移細胞特異性結合的BrBPl多肽。本專利技術通過ELISA鑒定噬菌體克隆與多種細胞系的結合，證實了噬菌體克隆與乳腺癌腦轉移細胞結合的特異性，通過競爭抑制實驗進一步鑒定噬菌體克隆與乳腺癌腦轉移細胞結合的特異性。本專利技術還分別從體外細胞水平和體內水平鑒定了噬菌體克隆與靶細胞結合的特異性。本專利技術還進一步證實了所述多肽可內化進入細胞，且呈現孵育時間依賴性。本專利技術所述的多肽可內化進入細胞，偶聯抗腫瘤藥物后可進入腫瘤細胞內殺傷靶細胞，大大增強抗腫瘤效果，可用于制備治療乳腺癌藥物。本專利技術所述的多肽通過與乳腺癌腦轉移細胞特異性結合，可制備試劑盒用于乳腺癌腦轉移早期診斷。有益效果:與現有技術相比，本專利技術的有益效果有，1、本專利技術篩選得到了一種與乳腺癌腦轉移細胞特異性結合的多肽，填補了目前缺乏與乳腺癌腦轉移細胞結合的多肽的空白；2、本專利技術篩選得到多肽為可通過人工方法合成的小分子多肽，分子量小、活性高、穿透力強、親和力高、特異性高、毒性低，適合作為靶向治療的載體；3、本專利技術篩選得到的多肽在體外和體外均具有良好的腫瘤靶向性，為該多肽的臨床前深入研究奠定了堅實的基礎；4、本專利技術篩選得到的多肽可內化進入細胞，偶聯抗腫瘤藥物后可進入腫瘤細胞內殺傷靶細胞，大大增強抗腫瘤效果。附圖說明圖1是細胞ELISA檢測的120個噬菌體單克隆的P/N比值圖；圖2是ELISA檢測Phage89、VCSMl3噬菌體克隆與不同腫瘤及正常細胞系親和力對比柱狀圖；圖3是BrBPl特異肽、Control對照肽競爭抑制Phage89與MDA-231BR結合的實驗結果 圖4 是熒光標記肽 BrBPl-K(5-TAMRA)、Control-K(5-TAMRA)與細胞系 MDA-231BR、HL-7702結合情況的細胞免疫熒光圖(放大倍數400X );圖5A是不同濃度BrBPl-K (5-TAMRA)與MDA-231BR結合的流式結果圖；圖5B是不同濃度Control-K (5-TAMRA)與MDA-231BR結合的流式結果圖5C 是定量分析圖 5A 和 5B 不同濃度 fcBPl-K (5-TAMRA)、Control_K (5-TAMRA)與MDA-231BR結合的陽性細胞百分含量圖；圖6是BrBPl競爭抑制BrBPl-K (5-TAMRA)與MDA-231BR結合的共聚焦顯微鏡結果圖(放大倍數400X);圖7是體內回輸實驗中噬菌體克隆Phage89及VCSM13在腫瘤及正常組織器官回收噬菌體滴度比值圖；圖8是近紅外熒光標記肽fcBPl-K (Cy5.5)、Control_K (Cy5.5)不同時間點的近紅外活體成像圖；圖9 是熒光標 記肽 fcBPl-K (5-TAMRA)、Contro 1-K (5-TAMRA)與 MDA-231BR 孵育不同時間的內化情況圖(放大倍數400 X )。具體實施例方式本專利技術實施例中所用實驗材料、主要試劑及配方如下:主要實驗材料:1、細胞株:乳腺癌腦轉移細胞系MDA-231BR和乳腺癌親代細胞系MDA-231P由美國國家癌癥研究所惠贈。乳腺癌細胞系MCF-7、卵巢癌細胞系SK-0V-3、胰腺癌細胞系PANC-1、胃癌細胞系BGC-823、結腸癌細胞系HT-29、前列腺癌細胞系PC-3、肝癌細胞系SMMC7721、人胚胎肝細胞系HL-7702、人胃粘膜永生化細胞系GES-1、人胚胎腎細胞系293T均購自中科院上海生命科學研究院細胞資源中心；2、噬菌體展示 12 肽庫 Ph.D.-12 及宿主菌 ER2738:購自 New England Biolabs ；3、裸鼠:購自軍事醫學科學院。主要試劑及配方:主要試劑:1、細胞培養試劑:胎牛血清(GIBC0)、DMEM 培養基(GIBCO)、DMS (Sigma)；2、卩遼本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種與乳腺癌腦轉移細胞特異性結合的多肽，命名為BrBP1，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。
【技術特征摘要】
1.一種與乳腺癌腦轉移細胞特異性結合的多肽，命名為BrBPl，其氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。2.一種制備權利要求1所述的與乳腺癌腦轉移細胞特異性結合的多肽的方法，其特征在于按以下步驟進行: (1)采用噬菌體展示技術，進行多輪全細胞消減篩選，初步篩選出與乳腺癌腦轉移細胞系結合的嗤囷體克隆； (2)隨機挑出若干個噬菌體克隆，通過細胞ELISA方法初步鑒定挑選出的噬菌體克隆與乳腺癌腦轉移細胞系的...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張建瓊，付波，張瑩，
申請(專利權)人：東南大學，
類型：發明
國別省市：
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