維生素B12 ELISA檢測試劑盒制造技術

本實用新型專利技術涉及一種檢測維生素B12的酶聯免疫試劑盒。該試劑盒組成包括：96孔酶標板、酶標二抗、維生素B12抗體工作液、5個濃度的標準品溶液、高濃度標準品、底物液A液、底物液B液、終止液、濃縮洗滌液、復溶液。采用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中的維生素B12與微孔條上預包被的偶聯抗原競爭抗維生素B12的抗體，加入酶標二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含維生素B12的含量成負相關，與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數，即可得出樣品中維生素B12的含量。與儀器分析技術相比具有使用方便、靈敏度高等特點，可在維生素B12的檢測中發揮重要作用。（*該技術在2022年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】

本技術涉及一種檢測維生素B12的酶聯免疫試劑盒。
技術介紹
維生素是各種生物維持正常生理功能所必需的一類低分子有機化合物，它們大多數是生化代謝過程中的主要輔酶，在體內參與、調節、控制許多合成和分解代謝，當生物體缺乏維生素時，就會引發物質代謝障礙，引起多種疾病。維生素B12又叫鈷胺素，其主要生理功能是參與制造骨髓紅細胞，防止惡性貧血，防止大腦神經受到破壞。維生素B12對于促進畜禽生長特別是在促進幼畜生長發育方面效果顯著，在畜禽體內主要以參與一碳單位和丙酸代謝發揮作用，影響遺傳物質的合成，還能維持神經功能的完整性，是畜禽不可缺少的營養原料。養殖生產過程中，常規飼料中的維生素B12—般作為安全用量，額外添加適量維生素B12可以提高畜禽生產性能，帶來可觀的經濟效益。近年來，余林梁等報道了以HPLC測定維生素H，鄧富良等用HPLC同時測定注射用水溶性維生素中維生素H和葉酸，任一平、龍朝陽等以HPLC測定食品中的葉酸，楊誼等以HPLC測定維生素B12。隋玉榮等用離子對色譜法測定了維生素B12及葉酸的含量，H.B.L1、Heudi用不同波長同時測定了維生素H、葉酸和維生素B12，宋金春等通過優化色譜條件，建立了同一波長條件下HPLC同時測定注射用水溶性維生素中維生素H、葉酸及維生素B12含量的方法。另外維生素B12的測定方法主要有比色法、電化學分析法、離子交換法、激光共振拉曼光譜法等，這些方法均是先測定樣品中Co含量，由鈷含量換算成VB12的含量，操作繁瑣，選擇性較差。劉保生等建立了利用A0-R6G能量轉移熒光猝滅法測定維生素B12的新方法。免疫學檢測方法也應用于維生素B12的檢測中，采用間接競爭ELISA方法測定維生素B12含量的方法，簡便、快速、靈敏度高，穩定性好，能滿足維生素B12的現場大批量樣品的快速篩選。
技術實現思路
本技術所要解決的問題是提供一種小巧輕便的維生素B12檢測試劑盒，其操作簡便，檢測快速、準確、靈敏度高，成本低，穩定性好，需要的技術含量不高，可進行一次連續多個樣品中維生素B12的測定，減少了檢測樣本所需要的時間。本技術的技術方案是:一種檢測維生素B12的酶聯免疫試劑盒，包括盒體和盒內的一塊96孔的酶標板、一張蓋板膜、13瓶試劑和放試劑的下凹瓶位、一個自封袋,其特征在于:采用96孔聚苯乙烯酶標板作為固相載體，酶標板由外框支撐架及放置其上的可拆的12條酶標反應微孔條組成，每個可拆裝酶標反應微孔條有8個反應孔，在試劑盒酶標板微孔條上預包被維生素B12偶聯抗原制成檢測板，放入真空鋁箔袋中，盒體為硬紙盒，以塑料硬膜為蓋板膜，將5瓶Iml梯度濃度的標準品溶液、Iml高濃度標準品溶液、12ml酶標二抗、7ml維生素B12抗體工作液、7ml底物液A液、7ml底物液B液、7ml終止液、40ml濃縮洗滌液、50ml復溶液試劑用不同大小、不同顏色的塑料瓶和玻璃瓶盛裝并固定在泡沫塑料模具中與酶標板、蓋板膜、自封袋、說明書、質檢報告一同封裝在硬紙盒內，以便于攜帶和運輸。每一個試劑盒中的試劑足夠進行96次測定(包括標準分析孔)，既可進行一次連續多個樣品的檢測，也可以將板孔拆開多次檢測。將剩下的放回鋁箔袋中用自封袋密封，這樣可以保證試劑盒檢測結果的準確性。檢測時，樣本中的維生素B12將和酶標板微孔條上預包被的偶聯抗原競爭抗維生素B12的抗體，加入酶標二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與樣本中所含維生素B12的含量成負相關，與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數，即可得出樣品中維生素B12含量，其操作簡便易行。經實驗表明本試劑盒檢測谷物類(玉米面、黃豆面、小米面、大米面)、牛奶、奶粉中維生素B12，具有很高的靈敏度，樣本的最低檢測限為谷物4μ g/kg，回收率為85%±15% ;奶粉4 μ g/kg，回收率為80%土 10% ;原奶I μ g/L,回收率為85%土 15% ;成品奶2 μ g/L,回收率為90%±10%。本試劑盒所需儀器較少，只需要酶標儀、振蕩器、渦旋儀、離心機、勻漿機和微量加樣器等，同類實驗室一般均有配備，所需成本較低。本技術的有益效果是:能快速、簡便、靈敏、準確地用于維生素B12的檢測。附圖說明圖1為本技術酶標板的側面縱剖面圖(長為8.55cm)；圖2為本技術酶標板的側面橫剖面圖(長為12.8cm)；圖3為本技術酶標板的俯視圖；圖4為本技術蓋板膜平面圖；圖5為本技術試劑瓶縱剖面平面圖；圖6為本技術固定泡沫模具俯視圖；圖7為本技術盒體與固定泡沫模具側視圖。參見附圖:酶標反應微孔條(2)預包被維生素B12偶聯抗原(3)固定于酶標板的外框支撐架(I)上，酶標反應微孔條(2)可隨要求拆卸；蓋板膜(4)用于酶標板置水浴或恒溫箱內反應時封蓋酶標反應微孔條(2)，蓋板膜大小與酶標板橫切面大小一致；透明帽的半透明塑料試劑瓶(5)用于封裝40ml濃縮洗滌液；藍色帽的半透明塑料試劑瓶(5)用于封裝50ml復溶液；白色帽的白色塑料試劑瓶(6)用于封裝7ml底物液A液，紅色帽的黑色塑料試劑瓶(6)用于封裝7ml底物液B液，黃色帽的白色塑料試劑瓶(6)用于封裝7ml終止液，紅色帽的白色塑料試劑瓶(7 )用于封裝12ml酶標二抗，綠色帽的白色塑料試劑瓶(7 )用于封裝7ml維生素B12抗體工作液，黑色帽的棕色玻璃瓶(8)用于封裝Iml/瓶的標準品溶液及Iml高濃度標準品溶液；盒體(9)是硬紙盒；泡沫塑料模具(10)有15個瓶位，放置位置依次為:40ml濃縮洗滌液瓶位(18)，50ml復溶液瓶位(11 )，7ml底物液A液瓶位(14)，7ml底物液B液瓶位(13)，7ml終止液瓶位(12)，7ml維生素B12抗體工作液瓶位(16)，12ml酶標二抗瓶位(15)，5種Iml/瓶各種濃度的標準品溶液及I瓶Iml高濃度標準品溶液瓶位(17)。具體實施方式一、樣本的前處理(I)谷物(玉米面、黃豆面、小米面、大米面)稱取1.0g±0.05g均質物至IOml聚苯乙烯離心管中，加入4ml 0.8mol/L磷酸鹽緩沖溶液，用振蕩器振蕩3min，3000g以上室溫離心5min ;取ΙΟΟμΙ上清液加入400μ1復溶液，用振蕩器振蕩3min,混勻；取50μ1用于分析。(2)奶粉稱取1.0g±0.05g均質物至IOml聚苯乙烯離心管中，加入4ml 10% NaCl溶液,立即用振蕩器振蕩3min ;使其完全溶解；取ΙΟΟμΙ上述溶解液加入400 μ I復溶液，用振蕩器振蕩3min,混勻；取50μ1用于分析。(3)原奶直接點板分析。(4)成品奶取50 μ I牛奶樣本加450 μ I復溶液混勻；取50 μ I用于分析。二、使用試劑盒的操作步驟1、將所需試劑從冷藏環境中取出，置于室溫(20_25°C)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。2、取出需要數量的微孔板，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2_8°C。3、洗滌工作液在使用前也需回溫。4、編號:將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。5、加標準品/樣本和抗體工作液:加標準品/樣本50 μ I到對應的微孔中，然后加入抗體工作液50 μ I/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25°C避本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種維生素B12的ELISA檢測試劑盒，包括盒體和盒內的一塊96孔的酶標板、一張蓋板膜、13瓶試劑和放試劑的下凹瓶位、一個自封袋，其特征在于：酶標板是采用96孔試劑板作為固相載體，在試劑盒微孔條上預包被維生素B12偶聯抗原制成的檢測板，13瓶試劑分別為5瓶標準品溶液、1瓶高濃度標準品溶液、酶標二抗、抗體工作液、底物液A液、底物液B液、終止液、濃縮洗滌液、復溶液。

【技術特征摘要】
1.一種維生素B12的ELISA檢測試劑盒，包括盒體和盒內的一塊96孔的酶標板、一張蓋板膜、13瓶試劑和放試劑的下凹瓶位、一個自封袋，其特征在于:酶標板是采用96孔試劑板作為固相載體，在試劑盒微孔條上預包被維生素B12偶聯抗原制成的檢測板，13瓶試劑分別為5瓶標準品溶液、I瓶高濃度標準品溶液、酶標二抗、抗體工作液、底物液A液、底物液B液、終止液、濃縮洗滌液、復溶液。2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:盒體是硬紙盒；96孔的聚苯乙烯酶標板，放于真空鋁箔袋內；蓋板膜是塑料硬膜；標準品溶液和高濃度標準品溶液均用黑色帽的棕色玻璃瓶，酶標二抗用紅色帽的白色PE塑料瓶，抗體工作液用綠色帽的白色PE塑料瓶，底物液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，底物液B液用紅色帽的黑色PE塑料瓶，終止液...

【專利技術屬性】
技術研發人員：何方洋，馮才偉，吳鵬，趙赫，吳小勝，劉琳，張荃，石潔，
申請(專利權)人：北京勤邦生物技術有限公司，
類型：實用新型
國別省市：