本發明專利技術公開了一種檢測25-羥基維生素D3含量的試劑盒及其制備方法和應用。所述試劑盒由彼此獨立的試劑Ⅰ和試劑Ⅱ組成；其中，試劑Ⅰ的組分包括：25-羥基維生素D3-BSA偶聯物、生物緩沖劑、螯合劑、表面活性劑、促凝劑、防腐劑、穩定劑和水；試劑Ⅱ的組分包括：包被25-羥基維生素D3抗體的膠乳顆粒、生物緩沖劑、螯合劑、表面活性劑、助懸劑、防腐劑、封閉劑、穩定劑和水。本發明專利技術試劑盒檢測靈敏度高，特異性強，定量準確，線性范圍寬，尤其適用于25-羥基維生素D3含量極低樣品的檢測。此外，本發明專利技術試劑盒在檢測過程中不需對樣本進行預稀釋，方便臨床使用，操作簡單、檢測成本低，適用于各種全自動生化分析儀。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種檢測人體內25-羥基維生素D3含量的試劑盒及其制備方法，本專利技術還涉及該25-羥基維生素D3測定試劑盒在檢測人體內25-羥基維生素D3含量的使用方法，屬于25-羥基維生素D3含量的檢測領域。
技術介紹
25-羥基維生素D3是人體內存儲維生素D的主要形式之一，它是人體正常代謝活動不可或缺的物質之一。總體而言，全球三分之二的人缺乏維生素D，其中，在兒童、老人和孕婦中更容易出現維生素D缺乏的現象。體內維生素D的缺乏，使兒童患佝僂病和老人患骨質疏松癥的可能性大大增加。近年來大量研究表明，維生素D的缺乏直接影響到人體內腫瘤的發生，特別是結腸癌、乳腺癌和前列腺癌；目前，維生素D的缺乏已被證實為判別腺癌發生的重要標志物，在臨床診斷上將成為一項重要的指標。此外，維生素D的缺乏還與自身免疫性疾病、感染性疾病和心血管疾病等的發生有著密切的關系。目前，臨床上對維生素D的定量檢測已成為常規檢測項目和體檢項目。為此，建立一種快速、簡便、靈敏、準確可靠的檢測維生素D水平的方法尤為重要。近幾年來，25-羥基維生素D3的定量檢測主要有理化檢驗方法和免疫學方法。理化檢驗方法主要有液相色譜-質譜聯用技術(LC-MS)；免疫學方法主要有放射免疫法(RIA)和酶聯免疫吸附法(ELISA)。液相色譜-質譜聯用(LC-MS)的檢測方法雖然靈敏度高，但是存在儀器昂貴、樣品前處理復雜、操作繁瑣、檢測時間長等諸多弊端。放射免疫法雖然存在操作簡單、特異性強、靈敏度高等優勢，但是同樣存在著輻射污染以及穩定性差等方面的缺陷。酶聯免疫吸附法(ELISA)雖然準確、靈敏度高，但是存在操作要求嚴格且費時等缺陷，不適用于急診和臨床病人及時診斷和治療的需要。迄今為止，尚缺乏一種操作簡單快速、定量準確、敏感度高或特異性強的用于檢測人體內25-羥基維生素D3含量的試劑盒。
技術實現思路
本專利技術的目的之一是提供一種25-羥基維生素D3檢測試劑盒；本專利技術的目的之二是提供一種制備所述25-羥基維生素D3檢測試劑盒的方法。本專利技術的上述目的是通過以下技術方案來實現的一種檢測25-羥基維生素D3含量的試劑盒，由彼此獨立的試劑I和試劑II組成；其中，試劑I的組分包括25-羥基維生素D3-BSA偶聯物、生物緩沖劑、螯合劑、表面活性齊U、促凝劑、防腐劑、穩定劑和水；試劑II的組分包括包被25-羥基維生素D3抗體的膠乳顆粒、生物緩沖劑、螯合齊U、表面活性劑、助懸劑、防腐齊U、封閉齊U、穩定劑和水。本專利技術發現，試劑I或試劑II中各組分的用量對于檢測的準確度、靈敏度及特異性均有著非常顯著的影響；本專利技術通過大量的優選試驗最終篩選到了試劑I或試劑II中各組分的最佳用量，采用下述這些優選的用量能夠有效提高檢測結果的準確度、靈敏度及特異性每I升試劑I中各組分的用量優選為25-羥基維生素D3-BSA偶聯物0. 05_50mg，生物緩沖劑l-100g，螯合劑0. l-10g，表面活性劑0. l_5mL，防腐劑0. l_10g，穩定劑l_50g，促凝劑l_50g，余量為水；進一步優選的，每I升試劑I中各組分的用量為25_羥基維生素D3-BSA偶聯物0. l-30mg,生物緩沖劑5-50g，螯合劑0. 5_5g，表面活性劑0. 5_4mL，防腐劑0. 5_5g，穩定劑10-40g，促凝劑10-40g，余量為水；更進一步優選的，每I升試劑I中各組分的用量為25_羥基維生素D3-BSA偶聯物0. 5-20mg,生物緩沖劑10_20g，螯合劑0. 7_2g，表面活性劑0. 7_2mL，防腐劑0. 6-1. 5g，穩定劑15-30g，促凝劑12-30g，余量為水；最優選的，每I升試劑I中各組分的用量為25-羥基維生素D3-BSA偶聯物5mg，生物緩沖劑12g，螯合劑lg，表面活性劑0. 5mL，防腐劑lg，穩定劑20g，促凝劑15g，余量為水；每I升試劑II中各組分的用量優選為包被25-羥基維生素D3抗體的膠乳顆粒0. l-10g，生物緩沖劑l-100g，螯合劑0. l-10g，表面活性劑0. 1-lOmL，防腐劑0. l_10g，助懸劑5-50mL，封閉劑5-50g，穩定劑50_150g，余量為水。進一步優選的，每I升試劑II中各組分的用量為包被25-羥基維生素D3抗體膠乳顆粒0. 5-5g，生物緩沖劑5-40g，螯合劑0. 5-5g，表面活性劑l_7mL，防腐劑0. 5_5g，助懸劑10-40mL，封閉劑6-30g，穩定劑80_140g，余量為水。更進一步優選的，每I升試劑II中各組分的用量為包被25-羥基維生素D3抗體膠乳顆粒0. 8-3g，生物緩沖劑8-15g，螯合劑l-3g，表面活性劑l_4mL，防腐劑0. 7_2g，助懸劑15-30mL，封閉劑8-15g，穩定劑90_120g，余量為水。最優選的，每I升試劑II中各組分的用量為包被25-羥基維生素D 3抗體膠乳顆粒1. 8g，生物緩沖劑10. 5g，螯合劑2g，表面活性劑3mL，防腐劑lg，助懸劑20mL，封閉劑10g，穩定劑100g，余量為水。為了實現更好的檢測效果，試劑I的pH值的范圍優選為7. 0-8.0，試劑II的pH值的范圍優選為6. 5-7.5。本專利技術試劑II中所述的“包被25-羥基維生素D3抗體的膠乳顆粒”是在磷酸鹽緩沖液中將25-羥基維生素D3抗體通過物理吸附或化學交聯等方法結合到羧化改性聚苯乙烯膠乳顆粒的表面，再經過離心、洗滌后所得；其中，所述的25-羥基維生素D3抗體可以是25-羥基維生素D3單克隆抗體或多克隆抗體。可以通過物理吸附或化學交聯的方法將25-羥基維生素D3抗體結合聚苯乙烯膠乳顆粒的表面。物理吸附的抗體在長時間放置后，抗體蛋白容易解吸附，導致檢測靈敏度降低，重復性較差。本專利技術優選采用通過化學交聯的方法將25-羥基維生素D3抗體結合到羧化改性聚苯乙烯膠乳顆粒的表面，這樣能夠使結合的抗體更加穩定。優選的，一種制備包被25-羥基維生素D3單克隆抗體或多克隆抗體膠乳顆粒的方法，包括以下步驟①將聚苯乙烯膠乳顆粒用磷酸鹽緩沖液分散，再加入6-氨基己酸溶液和1-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)，攪拌均勻后，離心棄上清；再用磷酸鹽緩沖液稀釋分散沉淀膠乳得到羧化改性聚苯乙烯膠乳溶液；②將25-羥基維生素D3單克隆抗體或多克隆抗體凍干品用去離子水溶解，制成抗體溶液；③取抗體溶液，用磷酸鹽緩沖液稀釋后，加入步驟①所制備的羧化改性聚苯乙烯膠乳溶液，再加入EDC，在0-4°C攪拌反應，加入甘氨酸緩沖液攪拌，終止反應，離心棄上清，用磷酸鹽緩沖液洗滌沉淀，得到包被25-羥基維生素D3抗體膠乳顆粒。試劑I或試劑II中所述的生物緩沖劑主要是起到中和酸堿的作用，所以能夠起到中和酸堿作用的各種緩沖劑均能夠適用于本專利技術的生物緩沖劑，例如可以是三羥甲基氨基甲烷(Tris)、三羥甲基甲胺基乙磺酸(TES)、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)、N-(2-羥乙基)哌嗪-N' -2-乙烷磺酸(HEPES)、三羥甲基甲胺基丙磺酸(TAPS)、哌嗪-1,4-二羥基丙磺酸(P0PS0)、3- (N-嗎啉)丙磺酸(MOPS)等各種常用生物緩沖液，為了達到更好的檢測效果，試劑I中所述的生物緩沖劑優選為三羥甲基氨基甲烷，試劑II中所述的生物本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種檢測25?羥基維生素D3含量的試劑盒，其特征在于：由彼此獨立的試劑Ⅰ和試劑Ⅱ組成；其中，試劑Ⅰ的組分包括：25?羥基維生素D3?BSA偶聯物、生物緩沖劑、螯合劑、表面活性劑、促凝劑、防腐劑、穩定劑和水；試劑Ⅱ的組分包括：包被25?羥基維生素D3抗體的膠乳顆粒、生物緩沖劑、螯合劑、表面活性劑、助懸劑、防腐劑、封閉劑、穩定劑和水。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：華權高，沈鶴霄，許可，閆彩霞，常向博，舒芹，余箭翔，
申請(專利權)人：武漢華美生物工程有限公司，
類型：發明
國別省市：
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