維生素D化合物的釋放制劑制造技術

本發明專利技術涉及用于釋放與維生素D-結合蛋白結合的維生素D化合物的試劑組合物，用于檢測維生素D化合物的體外方法，其中通過使用該試劑組合物，使得所述維生素D化合物從維生素D-結合蛋白釋放，且還涉及以該方式獲得的試劑混合物。所使用的試劑含有濃度為0.1M至2.0M的碳酸氫鹽或者能夠在水解后釋放碳酸氫根離子(HCO3-)的物質。本發明專利技術還涉及所披露的用于釋放維生素D化合物的試劑組合物的用途以及用于檢測維生素D化合物的試劑盒，其含有常見檢測試劑之外的用于釋放除維生素D化合物的試劑組合物。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及用于釋放與維生素D-結合蛋白結合的維生素D化合物的試劑組合物(reagent composition),用于檢測維生素D化合物的體外方法,其中通過使用該試劑組合物，使得所述維生素D化合物從維生素D-結合蛋白釋放，且還涉及以該方式獲得的試劑混合物。本專利技術還涉及所披露的用于釋放維生素D化合物的試劑組合物的用途以及用于檢測維生素D化合物的試劑盒，其含有除常見檢測試劑之外的用于釋放維生素D化合物的試劑組合物。
技術介紹
·維生素D的充分供給是極其重要的，如術語“維他命(vitamin) ”早已暗示的那樣。維生素D的缺乏導致嚴重的疾病諸如佝僂病或者骨質疏松。雖然在上個世紀的早期，維生素D仍然被看作一種單一物質，但是在過去的幾十年內，維生素D系統已經變為一種維生素D代謝產物的復雜且多樣的網絡。如今，40種以上的不同的維生素D代謝產物是已知的(Zerwekh, J. E. , Ann. Clin. Biochem. 41 (2004) 272-281)。人類只能通過來自陽光的紫外線作用于皮膚上而產生D3維生素或者維生素D2(CalCiferols)。在血液中，維生素D3結合到所謂的維生素D-結合蛋白，并將其輸送到肝臟中，在此通過25-羥基化作用將其轉化為25-羥基維生素D3。除皮膚和肝臟之夕卜，許多其它組織目前已知涉及維生素D新陳代謝，而上述兩個器官早已在下述文獻中提及(Schmidt-Gayk, H. et al. (eds.), “Calcium regulating hormones, vitamin Dmetabolites and cyclic AMP^, SpringerVerlag, Heidelberg(1990)pp. 24-47) 25-輕基維生素D，更具體地說，25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3,就其數量而言，是人有機體中的重要存儲形式。當需要時，這些前體可以在腎中轉化而形成生物活性的Ia，25_ 二羥基維生素D，所謂的D激素。生物活性的維生素D調節從腸的鈣攝取、骨礦化，并且影響許多其它代謝途徑諸如胰島素體系。測量維生素D水平本身是沒有多少益處的，當測定患者的維生素D狀況時，因為取決于食物攝取或者暴露于陽光，維生素D (維生素D2和維生素D3)的濃度變化很大。另外，在循環(24小時)中維生素D具有較短的生物半衰期，因此出于這種原因也不是合適的測定患者的維生素D狀況的參數。同樣也適用于生理活性形式的維生素D (1，25- 二羥基維生素D)。相比于25-羥基維生素D而言，這些生物活性形式同樣以較小的且較大波動的濃度存在。由于全部這些原因，特別地，25-羥基維生素D的量化是一種合適的全面分析患者的總的維生素D狀況的手段。維生素D代謝產物如25-羥基維生素D以高親和性由維生素D-結合蛋白結合且也以受限的程度與白蛋白和一些脂蛋白結合。在正常情況下適于從維生素D-結合蛋白釋放維生素D代謝產物的方法相比于從任何其它蛋白釋放維生素D代謝產物而言將是非常適當的。25-羥基維生素D或者其它維生素D化合物對維生素D-結合蛋白的結合使得維生素D化合物的確定極大地復雜化。全部已知的方法要求待分析的維生素D化合物從其與維生素D-結合蛋白形成的復合物中釋放或者分離。在下文中，為了簡化的目的，這被稱為從維生素D-結合蛋白中釋放維生素D化合物，雖然當然其只能從維生素D化合物和維生素D-結合蛋白的復合物中，而不是單獨地從維生素D-結合蛋白中被釋放。維生素D-結合蛋白在酸性pH條件下為未折疊的，但在pH重新變為中性條件時，其具有正確重折疊且重新結合分析物的高趨勢。因此，通常需要首先釋放維生素D化合物，然后將所述維生素D-結合蛋白與待分析的維生素D化合物分離。由于2 5-羥基維生素D的高的臨床價值，許多方法從文獻中是已知的，這使得25-羥基維生素D可以或多或少被可靠地確定。 Haddad, J. G. et al.，J. Cl in. Endocrinol. Metab. 33 (1971) 992-995,和Eisman, J. A. et al. , Anal. Biochem. 80 (1977) 298-305 例如描述了使用高效液相色譜(HPLC)確定血液樣品中25-羥基維生素D的濃度。其它確定25-羥基維生素D的方法尤其是基于使用維生素D-結合蛋白，如牛奶中存在的那些。因此，Holick, M. F. and Ray, R. (US 5, 981, 779)以及 DeLuca et al. (EP O583 945)描述了用于羥基維生素D和二羥基維生素D的維生素D測定，其基于這些物質結合到維生素D-結合蛋白，其中這些物質的濃度是通過競爭性測試程序確定的。然而，這種方法的先決條件是待確定的維生素D代謝產物首先需要從原始的血液或者血清樣品中分離并且必需通過例如色譜進行純化。Armbruster, F. P. et al. (W0 99/67211)教導了為通過乙醇沉淀法進行維生素D確定，應當制備血清或者血漿樣品。在這種方法中，通過離心作用除去蛋白質沉淀物，并且乙醇(ethanolic)上清液包含可溶維生素D代謝產物。這些可以在競爭性結合測定中進行測量。可選擇地，EP O 753 743教導了使用高碘酸鹽，蛋白質可以和血液或者血清樣品分離。在這種情況下，在獲自用高碘酸鹽處理的樣品的不含蛋白質的上清液中確定維生素D化合物。在一些商業測試中，乙腈被推薦用于萃取血清或者血漿樣品(例如，在DiaSorin的放射免疫測定中或者在“Immundiagnostik”公司的維生素D測試中)。最近幾年中，許多不同的釋放試劑被提出，其原則上應當適于從樣品中存在的任何結合蛋白中釋放維生素D化合物。然而,這種釋放或者脫附(detachment)應當在相對溫和條件下進行，使得能夠在結合測試中直接使用用釋放試劑處理的樣品(參見例如WO02/57797和US 2004/0132104)。最近幾年中雖然進行了很多努力，但是用于確定維生素D的所有可得的方法具有缺點，諸如費力的樣品制備，差的標準化，測試程序間的差的一致性或者加料(spiked)維生素D的差的回收(就此特別參見Zerwekh, J. E.，見上文)。在US 7，087，395中，金屬氫氧化物和環糊精及其衍生物以及金屬水楊酸鹽已經用于從維生素D-結合蛋白釋放維生素D化合物，這導致了維生素D-結合蛋白或者其它血清蛋白的不可逆的變性。表面活性劑如Triton X100或者Tween-20已經用于防止維生素D化合物與變性后的樣品中的脂質和蛋白進行非特異性結合。特別難以使維生素D化合物的測試自動化。自動化要求解決非常困難的問題，即鋼絲行走生存(surviving a tightrope walk):一方面,必需在合適的釋放試劑的幫助下從維生素D-結合蛋白中釋放維生素D化合物，另一方面，條件必需被選擇使得所述樣品可以直接進行進一步的分析。這種直接進一步的分析的先決條件是，一方面，內源性維生素D-結合蛋白在這種分析期間沒有結合或者不再顯著地結合維生素D化合物并由此不妨礙這種分析，而另一方面，所用的釋放試劑沒有妨礙檢測試劑諸如抗體或維生素D-結合蛋白的結合。另外，眾所周知本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：S安東尼，C沃格爾，
申請(專利權)人：霍夫曼拉羅奇有限公司，
類型：
國別省市：