基于定量PCR的使用重復(fù)DNA元件作為陰性對照預(yù)測用于下一代測序的靶標(biāo)富集的效率的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種基于定量PCR的使用重復(fù)DNA元件作為陰性對照預(yù)測用于下一代測序的靶標(biāo)富集的效率的方法。用于測定從DNA文庫中的靶標(biāo)富集的效率的方法包括：將陰性對照序列和陽性對照序列添加至DNA文庫，或從文庫中挑選陰性對照序列和/或陽性對照序列；測定陰性對照序列的捕獲前的量和陽性對照序列的捕獲前的量；使用誘餌序列對來自DNA文庫的靶標(biāo)序列進(jìn)行富集以產(chǎn)生捕獲后文庫；測定捕獲后文庫中的陰性對照序列的捕獲后的量和陽性對照序列的捕獲后的量；并基于陽性對照序列的捕獲后的量、陰性對照序列的捕獲后的量、陽性對照序列的捕獲前的量和陰性對照序列的捕獲前的量，測定靶標(biāo)富集的效率。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
基于定量PCR的使用重復(fù)DNA元件作為陰性對照預(yù)測用于下一代測序的靶標(biāo)富集的效率的方法
本專利技術(shù)涉及DNA文庫組成分析領(lǐng)域，特別是分析DNA文庫中的序列的相對豐度變化的方法。
技術(shù)介紹
用于對基因組測序的更為有效的技術(shù)的需求已導(dǎo)致下一代基因組測序技術(shù)的開發(fā)。雖然這些下一代測序技術(shù)已徹底改革了對基因組測序的方式，這些技術(shù)具有其弱點(diǎn)。例如，這些技術(shù)不能容易地靶向基因組的特定區(qū)域。對基因組的特定區(qū)域測序的能力具有許多應(yīng)用。例如，一些疾病由僅僅少數(shù)核苷酸的突變引起。對整個(gè)人類基因組測序以鑒定這些少數(shù)突變是低效的。類似地，許多復(fù)雜疾病涉及單核苷酸多態(tài)性(SNP)或與疾病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)的SNP組。鑒定基因組中的此種SNP是費(fèi)力的任務(wù)，因?yàn)槠浒▽碜允芮忠u個(gè)體的基因組DNA的大的區(qū)域(典型地，大于100千堿基)測序以查找單個(gè)堿基變化或鑒定所有序列變體。為了使該任務(wù)便利，已開發(fā)了更新的方法，所述方法包括在分析或測序之前針對感興趣的序列富集文庫。富集之后，感興趣的序列的亞組可被更為有效地測序。富集系統(tǒng)典型地使用含有感興趣的區(qū)域周圍的序列的寡核苷酸探針作為誘餌從DNA文庫釣取(通過雜交)感興趣的DNA片段。這些寡核苷酸探針通常包括可促進(jìn)雜交序列從文庫分離的把手。這種富集系統(tǒng)的例子是從AgilentTechnologies，Inc.(SantaClara，CA)可得到的SureSelectTM系統(tǒng)。SureSelectTM系統(tǒng)使用基于生物素-抗生素蛋白的選擇技術(shù)以富集感興趣的序列。該系統(tǒng)可顯著改進(jìn)測序工作流程的花費(fèi)和過程效率。圖1顯示了圖解使用SureSelectTM從文庫中富集感興趣的DNA序列的方法的圖。如在圖1中所示的，通過將序列片段克隆進(jìn)連接物(adaptor)中，制備基因組文庫樣品。接著用生物素標(biāo)記的RNA誘餌(即，有生物素標(biāo)簽的RNA寡核苷酸)探查該文庫。雜交后，使用鏈霉親和素-涂覆的磁珠從混合物中分離與生物素標(biāo)記的誘餌結(jié)合的序列。洗滌珠粒(具有結(jié)合的序列)，然后消化RNA序列以釋放作為單鏈DNA序列的富集的靶標(biāo)序列。然后可使用PCR擴(kuò)增感興趣的DNA序列以產(chǎn)生用于進(jìn)一步分析或測序的富集的序列。該富集方法允許人們相對容易地關(guān)注感興趣的序列。最近在美國專利申請No.20110184161中公開了類似的方法。根據(jù)在該申請中描述的方法，含有片段化的變性的基因組核酸分子的樣品在雜交條件下與固定在底物上的寡核苷酸探針接觸。然后與固定的探針雜交的感興趣的核酸分子與其他序列分離，并且結(jié)合的DNA片段被從底物中洗脫出來以產(chǎn)生富集的文庫。對于此類富集方法，期望的是，在人們做出努力來對富集的文庫測序之前，能夠證實(shí)靶標(biāo)序列的確被富集(以及富集到什么程度)了。因而，在富集方法中通常包括陽性對照序列和誘餌以容許對富集監(jiān)測。如果富集的定量估計(jì)是期望的，也可包括內(nèi)標(biāo)物序列。富集循環(huán)后或當(dāng)富集的估計(jì)是期望的時(shí)，可從富集的文庫中取出一小份并典型地用擴(kuò)增技術(shù)，比如定量PCR(qPCR)進(jìn)行分析。定量PCR(qPCR)(或?qū)崟r(shí)PCR)可用來擴(kuò)增并同時(shí)定量靶向的DNA分子。所述方法包括擴(kuò)增DNA樣品中的一種或多種特定序列的PCR。同時(shí)，在反應(yīng)混合物中包括探針(典型地，熒光探針)以提供實(shí)時(shí)定量。用于實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)物的定量的兩種常用的熒光探針是：(1)以非序列特異性方式嵌入雙鏈DNA分子的非-序列-特異性熒光染料(例如，Green)，和(2)僅在與DNA靶標(biāo)雜交后或并入PCR產(chǎn)物后容許檢測的序列-特異性DNA探針(例如，標(biāo)記有熒光報(bào)告子的寡核苷酸)。熒光報(bào)告子的例子可包括具有被另一基團(tuán)淬滅的一種熒光團(tuán)的探針。當(dāng)探針被并入擴(kuò)增的序列時(shí)，熒光團(tuán)分子或熒光淬滅劑分子被切割，允許熒光團(tuán)發(fā)光。該方法的例子是檢驗(yàn)，如在美國專利NO.5,723,591中描述的。檢驗(yàn)使用中心探針寡核苷酸側(cè)翼的兩條PCR引物。探針寡核苷酸含有熒光團(tuán)和淬滅劑。PCR方法的聚合步驟期間，聚合酶切割探針寡核苷酸。該切割引起熒光團(tuán)和淬滅劑被物理上分離，這引起熒光發(fā)射變化。因?yàn)楫a(chǎn)生了更多PCR產(chǎn)物，熒光信號(hào)的強(qiáng)度增加了。用這些現(xiàn)有技術(shù)，人們可以更高的可信度監(jiān)測DNA文庫的富集。但是，仍存在對可用來監(jiān)測富集過程的方法的需要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)一個(gè)方面涉及測定從DNA文庫中的靶標(biāo)富集的效率的方法。根據(jù)本專利技術(shù)的一種實(shí)施方式的方法包括下述步驟：將陰性對照序列和/或陽性對照序列添加至DNA文庫，或從DNA文庫挑選陰性對照序列和/或陽性對照序列；測定DNA文庫中的陰性對照序列的捕獲前的量和陽性對照序列的捕獲前的量；使用至少一種誘餌序列進(jìn)行來自DNA文庫的靶標(biāo)序列的富集以產(chǎn)生捕獲后文庫；測定捕獲后文庫中的陰性對照序列的捕獲后的量和陽性對照序列的捕獲后的量；并基于陽性對照序列的捕獲后的量與陰性對照序列的捕獲后的量的比率，或基于將陽性對照序列的捕獲前的量和陰性對照序列的捕獲前的量的第一比率(i)，與陽性對照序列的捕獲后的量和陰性對照序列的捕獲后的量的第二比率(ii)進(jìn)行比較，測定靶標(biāo)富集的效率。本專利技術(shù)的另一方面涉及用于測定從DNA文庫中的靶標(biāo)富集的效率的方法。根據(jù)本專利技術(shù)的一種實(shí)施方式的方法包括下述步驟：將陰性對照序列添加至DNA文庫，或從DNA文庫中挑選陰性對照序列；測定DNA文庫中的陰性對照序列的捕獲前的量；使用至少一種誘餌序列，對來自DNA文庫的靶標(biāo)序列進(jìn)行富集以產(chǎn)生捕獲后文庫；測定捕獲后文庫中的陰性對照序列的捕獲后的量；通過比較陰性對照序列的捕獲前的量與陰性對照序列的捕獲后的量，測定靶標(biāo)富集的效率。本專利技術(shù)的其他方面和優(yōu)勢將從下述說明書和所附的權(quán)利要求中顯而易見。附圖簡述圖1顯示了示意性圖解使用來自AgilentTechnologies的SureSelectTM系統(tǒng)的靶標(biāo)富集的方法。圖2顯示了AluJo的序列以及根據(jù)本專利技術(shù)的一種實(shí)施方式用于AluJo序列的擴(kuò)增和定量的引物和探針。圖3顯示了L1MEe的序列以及根據(jù)本專利技術(shù)的一種實(shí)施方式用于L1MEe序列的擴(kuò)增和定量的引物和探針。圖4顯示了根據(jù)本專利技術(shù)的一種實(shí)施方式的qPCR檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖5顯示了根據(jù)本專利技術(shù)的一種實(shí)施方式，捕獲實(shí)驗(yàn)之前和之后的各種陽性對照序列和SINE陰性對照序列的量。圖6A顯示了使用各種文庫在捕獲實(shí)驗(yàn)前5種陽性對照序列和一種陰性對照序列(AluJo)的量。圖6B顯示了據(jù)本專利技術(shù)的一種實(shí)施方式捕獲實(shí)驗(yàn)后這些序列的量。圖7A顯示了在各種條件下，捕獲實(shí)驗(yàn)前5種陽性對照序列和一種陰性對照序列(AluJo)的量。圖7B顯示了根據(jù)本專利技術(shù)的一種實(shí)施方式，在捕獲實(shí)驗(yàn)后這些序列的量。圖8顯示了圖解根據(jù)本專利技術(shù)的一種實(shí)施方式的方法的流程圖。圖9顯示了圖解根據(jù)本專利技術(shù)的一種實(shí)施方式的方法的流程圖。專利技術(shù)詳述本專利技術(shù)的實(shí)施方式涉及用于監(jiān)測來自DNA文庫的感興趣的序列的富集的方法。如上文記錄的，在從DNA文庫富集感興趣的序列的方法中，已表明包括陽性對照允許人們監(jiān)測富集進(jìn)展。通過使用陰性對照序列，本專利技術(shù)的方法提供了富集監(jiān)測的其他改進(jìn)。本專利技術(shù)的方法可單獨(dú)使用陰性對照序列或與陽性對照序列組合使用陰性對照序列。本專利技術(shù)的實(shí)施方式提供了意料不到的益處，特別是當(dāng)與陽性對照序列一起使用時(shí)。此外，本專利技術(shù)的方法不是針對具體文庫設(shè)計(jì)的，因而具有一般的可應(yīng)用性，而不需考慮靶標(biāo)靶向文庫。本文中使用時(shí)本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
用于測定從DNA文庫中富集靶標(biāo)的效率的方法，其包括：將陰性對照序列和/或陽性對照序列添加至DNA文庫，或從DNA文庫中挑選陰性對照序列和/或陽性對照序列；測定DNA文庫中的陰性對照序列的捕獲前的量和陽性對照序列的捕獲前的量；使用至少一種誘餌序列對來自DNA文庫的靶標(biāo)序列進(jìn)行富集以產(chǎn)生捕獲后文庫；測定在所述捕獲后文庫中的所述陰性對照序列的捕獲后的量和所述陽性對照序列的捕獲后的量；并基于所述陽性對照序列的捕獲后的量與所述陰性對照序列的捕獲后的量的比率，或基于將所述陽性對照序列的捕獲前的量與所述陰性對照序列的捕獲前的量的第一比率(i)與所述陽性對照序列的捕獲后的量與所述陰性對照序列的捕獲后的量的第二比率(ii)進(jìn)行比較測定所述靶標(biāo)富集的效率。

【技術(shù)特征摘要】
2011.11.30 US 13/308,4821.用于測定從DNA文庫中富集靶標(biāo)的效率的方法，其包括：將陰性對照序列添加至DNA文庫或從DNA文庫中挑選陰性對照序列，且將陽性對照序列添加至DNA文庫或從DNA文庫中挑選陽性對照序列；測定DNA文庫中的陰性對照序列的捕獲前的量和陽性對照序列的捕獲前的量；使用至少一種誘餌序列對來自DNA文庫的靶標(biāo)序列進(jìn)行富集以產(chǎn)生捕獲后文庫；測定在所述捕獲后文庫中的所述陰性對照序列的捕獲后的量和所述陽性對照序列的捕獲后的量；并基于所述陽性對照序列的捕獲后的量與所述陰性對照序列的捕獲后的量的比率，或基于將所述陽性對照序列的捕獲前的量與所述陰性對照序列的捕獲前的量的第一比率(i)與所述陽性對照序列的捕獲后的量與所述陰性對照序列的捕獲后的量的第二比率(ii)進(jìn)行比較測定所述靶標(biāo)富集的效率，其中所述陰性對照序列是選自長散布元件(LINE)或短散布元件(SINE)的重復(fù)元件，所述陽性對照序列是在DNA文庫中找到的那些或摻入DNA文庫的外源序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述重復(fù)元件是Alu元件。3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述重復(fù)元件是AluJo，AluJo的序列為SEQIDNO:1。4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述重復(fù)元件是L1MEe，L...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：斯科特·哈珀，約瑟夫·晃·海·翁，
申請(專利權(quán))人：安捷倫科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：