本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種在RESOLFT顯微術(shù)中用于照明和探測的方法，采用脈沖或連續(xù)的光源以產(chǎn)生激發(fā)光和轉(zhuǎn)換光，其特征在于以脈沖的形式照射激發(fā)光（4）且激發(fā)光（4）的脈沖長度超過150皮秒，優(yōu)選地長至幾百皮秒，長達(dá)幾納秒。相應(yīng)的裝置使用根據(jù)本發(fā)明專利技術(shù)的方法。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及在RESOLFT顯微術(shù)中使用用于激發(fā)或轉(zhuǎn)換光的脈沖或連續(xù)光源進(jìn)行照明和探測的方法。本專利技術(shù)還涉及用于實(shí)施本專利技術(shù)的方法的裝置。
技術(shù)介紹
RESOLFT (可逆飽和光(熒光)轉(zhuǎn)移過程)顯微術(shù)包括ー組能夠以高放大率生成特別清晰的圖像的光顯微方法。盡管使用傳統(tǒng)的物鏡和衍射光束，但能夠獲得遠(yuǎn)超過衍射極限、達(dá)到分子尺度的分辨率(具體而言，可參見Stefan ff.Hell, Marcus Dyba及Stefan Jakobs:しoncepts for nanoscale resolution in fluorescence microscopy, Neurobiology 中的 Current Opinion, 2004，14:599-609 頁；Stefan W.Hell:Microscopy and its focalswitch, Special Features Perspective,第 6 卷第 I 其月,2009 年 I 月，Nature Methods)。在傳統(tǒng)光顯微鏡中，僅能區(qū)分相距約200nm的緊密特征。這是由光的波象性造成的。例如，在傳統(tǒng)的光顯微鏡中，分辨率主要由使用的光的波長和數(shù)值孔徑來決定。在RESOLFT顯微術(shù)中，克服了這ー極限。為此，染料被臨時地轉(zhuǎn)換至響應(yīng)于照明而不能發(fā)射(熒光)信號的狀態(tài)。根據(jù)上述說明，RESOLFT顯微術(shù)是克服了衍射極限的光顯微術(shù)的變型例。因此，使用RESOLFT顯微術(shù)，能夠探測并成像樣本中實(shí)際上彼此非常接近而難以分辨的特征。在RESOLFT 顯微術(shù)中，STED 顯微術(shù)(參見 Stefan ff.Hell, Jan Wichmann:Breakingthe diffraction resolution limit Dy stimulated emission:stimulatea—emission-depletion fluorescence microscopy, Optics Letters.19 卷第 11 器，1994, 780-782頁;Thomas A.Klar,Stefan ff.Hel1: Subdiffraction resolution in far-f ieldfluorescence microscopy, Optics Letters,第 24 卷第 14 期，1999，954-956 頁)和GSD 顯微術(shù)(參見 Volker Dose:Peer Review, EPL, A Letters Journal Exploring theFrontiers of Physics,第89卷，2009;Stefan ff.Hell M.Kroug:Ground-state_depletioniluorescence microscopy:a concept forbreaking the diffraction resolutionlimit, Applied Physics B: Lasers and Optics,第 60 卷第 5 期，1995，495-497 頁;StefanBretschneider,Christian Eggeling,Stefan W.Hei1:Breaking the diffractionbarrier in fluorescence microscopy by optical shelving,Physical Review Letters,第98卷第5期，2007，218103頁)的原理可歸納為能夠在兩個最廣義上的可區(qū)分的狀態(tài)之間可逆地轉(zhuǎn)換的任何類型的分子。通過光的影響來實(shí)現(xiàn)染料分子“轉(zhuǎn)換”至兩個可能的狀態(tài)中的至少ー個。在這一點(diǎn)上，術(shù)語“轉(zhuǎn)換”應(yīng)被最廣義地理解。RESOLFT顯微術(shù)中，待檢查的樣本被特殊的分子標(biāo)識，通常是熒光染料。有些使用染料分子中可光驅(qū)動區(qū)分的狀態(tài)。特別地，染料分子在至少兩個狀態(tài)之間來回轉(zhuǎn)換或上下轉(zhuǎn)換。這些狀態(tài)可以是給出信號的明亮狀態(tài)和不給出信號的黑暗狀態(tài)。借由光的作用來實(shí)現(xiàn)染料分子轉(zhuǎn)換至兩個狀態(tài)中的至少ー個。術(shù)語“RESOLFT顯微術(shù)”應(yīng)被理解為通用術(shù)語，其包括了根據(jù)相似的原理工作的不同方法。例如，STED (受激發(fā)射損耗)顯微術(shù)屬于RESOLFT顯微術(shù)。在這種方法中，熒光染料可在電子基態(tài)和激發(fā)態(tài)之間來回改變，并在這個過程中發(fā)出熒光。在黑暗狀態(tài)中，染料通過受激發(fā)射永久地維持在基態(tài)。因此，根據(jù)熒光染料在給出信號狀態(tài)中發(fā)出熒光、而在黑暗狀態(tài)中不發(fā)射光，存在著熒光染料的兩個配置。屬于RESOLFT顯微術(shù)的另一方法是GSD(基態(tài)損耗)顯微術(shù)。這里，熒光染料用作標(biāo)記。在明亮狀態(tài)中，熒光染料可在基態(tài)和激發(fā)態(tài)之間來回改變，并在這個過程中發(fā)出熒光。對于黑暗狀態(tài)，分子的基態(tài)減少。這意外著分子被激發(fā)至不發(fā)出熒光的長壽命狀態(tài)。一旦分子處于長壽命黑暗狀態(tài)，其基態(tài)不再可用，因而不能再被激發(fā)至發(fā)出熒光。返回至明亮狀態(tài)是自發(fā)地發(fā)生的。SPEM (飽和圖案激發(fā)顯微術(shù))和SSM (飽和結(jié)構(gòu)化照明顯微術(shù))也代表了 RESOLFT顯微木。在這些方法中，最初生成負(fù)像，隨后重構(gòu)數(shù)學(xué)圖像。根據(jù)上文給出的解釋，基態(tài)取代黑暗狀態(tài)。第一激發(fā)態(tài)相應(yīng)于明亮狀態(tài)。在RESOLFT顯微術(shù)的背景下還需要提及的另一方法是上變頻顯微術(shù)(參見 D.H.Kim 和 J.U.Kang:Upconversion microscopy for Dio1gica丄applications, Microscopy, Science, Technology, Applications and Education，571—582頁)。STAQ顯微術(shù)也被歸納在RESOLFT顯微術(shù)內(nèi)。需要注意的一點(diǎn)是，本專利技術(shù)一般地涉及RESOLFT顯微術(shù)中用于照明和探測的方法和裝置，無論使用何種特別的方法。重要的是，都使用RESOLFT的基本原理，這種原理的應(yīng)用可涉及所有可能代表該基本原理的方法。為簡化對本專利技術(shù)的教導(dǎo)的說明，使用STED顯微術(shù)這一例子來描述涉及RESOLFT的一般性教導(dǎo)，STED顯微術(shù)使用產(chǎn)生激發(fā)光和受激光(相應(yīng)于轉(zhuǎn)換光)的脈沖或連續(xù)光源。前述類型的相應(yīng)裝置描述在DE4416558C2中，特別地關(guān)于掃描共焦熒光顯微術(shù)。在該裝置中，為了增加橫向分辨率，使用激發(fā)光束照射樣本點(diǎn)，被激發(fā)光作用的熒光分子被轉(zhuǎn)變至激發(fā)態(tài)。此外，使用合適波長的受激光束照明樣本點(diǎn)，處于激發(fā)態(tài)的熒光分子可借由受激發(fā)射的過程返回至基態(tài)。該激發(fā)光束和受激光束(轉(zhuǎn)換光束)被布置成使得它們的光強(qiáng)分布或照明圖案至少部分地在目標(biāo)區(qū)域彼此重疊。在重疊區(qū)域的熒光分子在被激發(fā)光束激發(fā)后即刻因受激發(fā)射而被轉(zhuǎn)變至基態(tài)，因此僅探測位于激發(fā)光束照明圖案中的熒光分子所發(fā)出的光，而不探測位于受激光束的照明圖案中或兩個照明圖案的重疊區(qū)域中的熒光分子所發(fā)出的光。借由光學(xué)濾波器可將受激發(fā)射光和/或發(fā)射的受激光從掃描顯微術(shù)的探測光路中濾除，因而，僅探測來自除去了兩個照明圖案的重疊區(qū)域的激發(fā)光束的照明圖案區(qū)域的熒光。因此，產(chǎn)生熒光發(fā)射的目標(biāo)區(qū)域減少了，這降低了衍射受限成像的限制，從而提高了分辨率。已從DE10313138B4中獲知了 STED顯微術(shù)中用于照明或探測對象的裝置，其中主分束器采用的是基于受激光束的輻射功率本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種在RESOLFT顯微術(shù)中用于照明和探測的方法，其采用脈沖或連續(xù)的光源以產(chǎn)生激發(fā)光和轉(zhuǎn)換光，其中，以脈沖的形式照射激發(fā)光（4）；且激發(fā)光（4）的脈沖長度超過150皮秒，優(yōu)選地長至幾百皮秒，甚至長達(dá)幾納秒。
【技術(shù)特征摘要】
...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：J·佛林，
申請(專利權(quán))人：徠卡顯微系統(tǒng)復(fù)合顯微鏡有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：德國;DE
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