本發明專利技術公開了一種用于細胞培養的生物凝膠膜、制備方法及其應用，所述的生物凝膠膜含有生物相容性的Matrigel、氯化殼聚糖以及明膠。該生物凝膠膜可模擬體內細胞基底膜的結構、組成、物理特性和功能，能夠支持多種細胞的增殖。該生物凝膠膜在室溫下表現為液態，當溫度大于34℃變為凝膠膜，當溫度再降低時又變為半液體狀，即可以通過溫度的改變來回收細胞，減少酶的使用量，從而減小由酶消化細胞而引起細胞損失和功能改變，提高細胞的擴增效率。本發明專利技術中還提供了制備該生物凝膠膜的方法及在細胞培養中的應用。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種用于細胞培養的生物凝膠膜、制備方法及其應用，屬于細胞培養
技術介紹
細胞擴增是細胞治療和組織工程發展的必要前提，近年來發展的多種規模化培養貼壁細胞的新措施，已經在工程細胞系等大規模培養中廣泛應用，即，通過模擬細胞在體內的生長微環境與增值活動，控制其擴增與定向分化是培養細胞的基本出發點。目前多用具有良好生物相容性材料來模擬細胞外基質,促進細胞的體外擴增，主要包括透明質酸、膠原、殼聚糖、海藻酸鹽、明膠等。近年來，Matrigel由于其獨特的性能在細胞培養中受到越來越多的關注，Matrigel是EHS小鼠腫瘤中分離出，主要包含層粘連蛋白，IV型膠原，巢蛋白，硫酸肝素糖蛋白等組分，還包含有一些微量的生長因子，表皮生長因子，轉化生長因子-3，纖維細胞生長因子等。但是其價格昂貴，同時操作復雜，更重要的是收集細胞時仍然要加入酶來消化，酶消化過程容易對干細胞染色體組型的穩定性造成不利影響，同時，細胞作為細胞治療或組織工程的種子細胞使用時，動物來源的消化酶成分的混入可能對其臨床使用造成潛在的危險性。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種用于細胞培養的生物凝膠膜及其制備方法，以該方法制得復合膜含有具有生物相容性的Matrigel，氯化殼聚糖以及明膠，可模擬體內細胞基底膜的結構、組成、物理特性和功能，能夠促進多種細胞的增殖。本專利技術是通過下述技術方案加以實現:一種用于細胞培養的生物 凝膠膜，包含有Matrigel、氯化殼聚糖以及明膠。優選的，所述生物凝膠膜按照以下方法制備得到:(I)稱取一定量氯化殼聚糖，將其溶于去離子水中，制備成質量分數為1% -2%的氯化殼聚糖溶液，攪拌直至全部溶解，備用；(2)稱取一定量明膠，將其溶于去離子水中，制備成質量分數為1%_2%的明膠溶液，攪拌直至全部溶解，備用；(3)取一定體積的Matrigel溶液(自制或購自BD公司，貨號:354234)，在其中加入一定量的去離子水形成蛋白濃度為9-15mg/ml的Matrigel溶液，整個操作過程需在冰上操作；(4)按照1-2:1體積比量取一定量的步驟(I)制備的氯化殼聚糖溶液和步驟(2)制備的明膠溶液，混合攪拌，過濾滅菌備用；(5)稱取一定量的磷酸甘油鈉溶于去離子水中，形成質量濃度為10%的磷酸甘油鈉溶液，過濾滅菌備用；(6)在超凈工作臺中量取(4)制備的混合溶液5ml，在其中加入(3)制備的Matrigel溶液0.1-lml,加入0.l_2ml步驟(5)配制的磷酸甘油鈉溶液,混合攪拌2_10min,然后將其倒入細胞培養器皿或細胞培養板中，以上過程需在冰上操作；然后將其置于37°C培養箱中孵育10_40min，便可形成用于細胞培養的生物凝膠膜。9mg/ml的蛋白濃度(膠濃度)是Matrigel在特定溫度下(22_35°C )自己形成凝膠的最低濃度，本專利技術中形成凝膠通過兩種方式:(I)在復合膜中matrigel含量比較低時，主要通過與多糖交聯形成凝膠，Matrigel可與多糖形成半互穿網絡結構而形成復合凝膠；(2)當Matrigel濃度達到9mg/ml或以上時則與多糖共同形成雙網絡凝膠。進一步的，本專利技術還提出了一種用于細胞培養的生物凝膠膜制備方法，包括以下步驟:(I)稱取一定量氯化殼聚糖，將其溶于去離子水中，制備成質量分數為1%_2%的氯化殼聚糖溶液，攪拌直至全部溶解(備用)。(2)稱取一定量明膠，將其溶于去離子水中，制備成質量分數為的1%_2%明膠溶液，攪拌直至全部溶解(備用)。(3)取一定體積的Matrigel溶液(自制或購自BD公司，貨號:354234)，在其中加入一定量的去離子水形成蛋白濃度為9-15mg/ml的Matrigel溶液，整個操作過程需在冰上操作。(4)按照1-2:1體積比，量取一定量的步驟(I)制備的氯化殼聚糖溶液和步驟(2)制備的明膠溶液，混合攪拌，過濾滅菌備用。(5)稱取一定量的 磷酸甘油鈉溶于去離子水中，形成質量濃度為10%的磷酸甘油鈉溶液，過濾滅菌備用。(6)在超凈工作臺中量取(4)制備的混合溶液5ml，在其中加入(3)制備的Matrigel溶液0.1-lml,加入0.l_2ml步驟(5)配制的磷酸甘油鈉溶液,混合攪拌2_10min,然后將其倒入細胞培養器皿或細胞培養板中，以上過程需在冰上操作。然后將其置于37°C培養箱中孵育10_40min，便可形成用于細胞培養的生物凝膠膜。再進一步的，本專利技術還提出了所述的生物凝膠膜在培養細胞中應用。更進一步的，本專利技術提出了一種細胞培養方法，其特征在于包括以下步驟:(I)將細胞以一定的密度種植在本專利技術所述的生物凝膠膜上，常規培養一定的時間，隔天換液。(2)當細胞鋪滿整個凝膠膜時，將其置于4°C，10_30min，加入少量的消化細胞酶(胰酶)，離心收集細胞。本專利技術中用于細胞培養的生物凝膠膜可模擬體內細胞基底膜的結構、組成、物理特性和功能，能夠促進多種細胞的增殖，包括心肌細胞，胚胎干細胞或誘導多能干細胞(ips細胞)。例如，其可以支持心肌細胞的生長，如圖1所示，在其表面生長4天時的心肌細胞表現出良好的生長狀態，并具有心肌細胞的特定功能，顯微鏡下觀察到其能夠有節律的跳動；如圖2所示，在普通細胞培養板上生長的心肌細胞則出現球形。本專利技術中用于細胞培養的生物凝膠膜在室溫下該復合體系表現為液態，當溫度大于35°C變為凝膠膜，當溫度再降低時又變為半液體，即可以通過溫度的改變來回收細胞，減少酶的使用量，從而減少因酶消化細胞而引起細胞損失，提高細胞的擴增效率。附圖說明圖1為在本專利技術的生物凝膠膜上生長4天時的心肌細胞圖；圖2為在普通細胞培養板上生長4天時的心肌細胞圖。具體實施例方式下面通過實驗并結合實施例對本專利技術做進一步說明，應該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本專利技術的保護范圍。本領域普通技術人員理解，在本專利技術權利要求所限定的精神和范圍內可對其進行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本專利技術的保護范圍內。 實施例1:一種用于細胞培養的生物凝膠膜的制備(I)稱取2g氯化殼聚糖溶于98ml去離子水中，制備成質量分數為2%的氯化殼聚糖溶液，攪拌直至全部溶解(備用)。(2)稱取2g明膠溶于98ml去離子水中，制備成質量分數為2%的明膠溶液，攪拌直至全部溶解(備用)。(3)—定體積的Matrigel溶液(購買自BD公司，貨號:354234)，在其中加入一定量的去離子水形成蛋白濃度為9mg/ml的Matrigel溶液，整個操作過程需在冰上操作。(4)量取IOml的步驟(I)制備的氯化殼聚糖溶液和步驟(2)制備的IOml明膠溶液，混合攪拌，過濾滅菌備用。(5)稱Ig的磷酸甘油鈉溶于49ml去離子水中，形成質量分數為2%的磷酸甘油鈉溶液，過濾滅菌備用。(6)在超凈工作臺中量取(4)制備的混合溶液5ml，在其中加入(3)制備的Matrigel溶液0.1ml,加入0.4ml步驟(5)配制的磷酸甘油鈉溶液,混合攪拌IOmin,然后將其倒入細胞培養器皿或細胞培養板中，以上過程需在冰上操作。然后將其置于37°C培養箱中孵育30min，便可形成用于細胞培養的生物凝膠膜。實施例2:—種用于細胞培養的生物凝膠膜的制備(I)稱取2g氯化殼聚糖溶于98ml去離子水中，制備成質量濃度為2%氯化殼本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種用于細胞培養的生物凝膠膜，其特征在于所述生物凝膠膜包含有Matrigel、氯化殼聚糖以及明膠。
【技術特征摘要】
1.一種用于細胞培養的生物凝膠膜，其特征在于所述生物凝膠膜包含有Matrigel、氯化殼聚糖以及明膠。2.按權利要求1所述的生物凝膠膜，其特征在于所述生物凝膠膜按照以下方法制備得到: (1)稱取一定量氯化殼聚糖，將其溶于去離子水中，制備成質量分數為1%_2%的氯化殼聚糖溶液，攪拌直至全部溶解，備用； (2)稱取一定量明膠，將其溶于去離子水中，制備成質量分數為1%_2%的明膠溶液，攪拌直至全部溶解，備用； (3)取一定體積的Matrigel溶液，在其中加入一定量的去離子水形成蛋白濃度為9-15mg/ml的Matrigel溶液，整個操作過程需在冰上操作； (4)按照1-2:1體積比量取一定量的步驟(I)制備的氯化殼聚糖溶液和步驟(2)制備的明膠溶液,混合攪拌,過濾滅菌備用； (5)稱取一定量的磷酸甘油鈉溶于去離子水中，形成質量濃度為10%的磷酸甘油鈉溶液，過濾滅菌備用； (6 )在超凈工作臺中量取(4 )制備的混合溶液5ml，在其中加入(3 )制備的MatrigeI溶液0.1-lml，加入0.l-2ml步驟(5)配制的磷酸甘油鈉溶液，混合攪拌2_10min，然后將其倒入細胞培養器皿或細胞培養板中，以上過程需在冰上操作；然后將其置于37°C培養箱中孵育10-40min，便可形成用于細胞培養的生物凝膠膜。3.備權利要求1或 2所述的用于細胞培養的生物凝膠膜的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)稱取一定量氯化殼聚糖，將其溶于去離子水中，制備成質量分數為1%-2%的氯化殼聚糖溶液，攪拌...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李萌，
申請(專利權)人：黑龍江省重生生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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