本發明專利技術提供了檢測CHO細胞基因組DNA的引物對、包含該引物對的試劑盒以及利用該引物對檢測CHO細胞基因組DNA的方法，所述引物對特異性結合CHO細胞基因組DNA上SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2所示區段。利用所述引物對的PCR檢測方法操作簡便快捷、靈敏度高、能區分大腸桿菌或人類，甚至與倉鼠細胞高度同源的小鼠或大鼠的干擾性DNA。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物檢測領域。具體地說，本專利技術涉及CHO細胞DNA的檢測方法。
技術介紹
在現代，生物重組制品已廣泛應用于醫藥健康領域，發揮著越來越重要的作用。這些生物制品包括重組蛋白藥物、基因重組疫苗、生物抗原抗體以及各種細胞因子等。重組生物制品的應用與人類健康事業息息相關，國際上對其的質量控制和安全性檢測都具有極其嚴格的要求。重組生物蛋白絕大多數由大規模的基因改造工程宿主細胞生產，細胞中復雜的非目標產物是終產物中主要的雜質來源，直接影響生物制品的安全性。其中殘余的生物遺傳物質DNA是一個非常重要的污染，因此，對它的檢測是重要的質量控制環節。在重組生物蛋白制品中，殘余DNA多來源于培養的宿主細胞。這些宿主細胞多為外源哺乳動物細胞以及腫瘤來源細胞。理論上，存在于生物制品中的微量DNA雜質，都有可能傳遞與腫瘤或病毒相關的基因，并導致癌變或其它病理變化。當一定量的殘留DNA與制品一同進入人體后，含有致癌基因的DNA片段就可能誘發腫瘤的產生；如果生物制品中含有某些可以整合病毒的DNA，則這種DNA通過表達后具備感染性，從而導致一系列的不良后果。從1984年開始，國際官方機構陸續推出了針對生物制品殘余DNA檢測的各種限度標準，并且根據研究及 應用的不斷變化而逐步修改完善。1997年，WHO第46屆生物制品標準化專家委員會(ECBS)會議上，與會專家通過對傳代細胞系殘余DNA風險的再評估，認為殘余DNA雖然不是主要危險因素，但應視為細胞污染物，要求清除至最低水平。根據這一再評估，建議每人份傳代細胞的純化產品中可接受的DNA含量為10ng。任何生物制品的純化工藝應經驗證，證明其去除細胞DNA的能力，包括參入示蹤劑研究。另外，產品批次間的均一性應通過臨床效果觀察，以及三批以上的檢測結果予以證實。目前重組蛋白藥物常用的哺乳動物細胞系，如CHO、BHK、SP2/0、C127等，均有逆轉錄病毒顆粒陽性的報道。因此，對其殘余DNA含量就需要嚴格控制。目前，針對不同的生物制品，其相對應的檢測限也略有不同。一般而言，FDA規定醫藥生物制品中DNA污染的檢測限為IOOpg/劑，WHO和EU略為寬松，檢測限可達IOng/劑。低濃度的檢測限對檢測的手段及技術提出了更高的要求。關于生物制品中宿主細胞殘余DNA的限量檢測，過去比較普遍的采用分子雜交的半定量方法。該方法基于傳統的分子基因雜交技術，需要的檢測條件相對簡單，檢測限在IOpg左右基本能夠滿足一些疫苗和治療性生物制品的檢測需求。但由于該方法存在時間長、操作繁瑣、穩定性、敏感性、特異性較差等缺點，已經不能滿足日益嚴苛的檢測要求，在一些發達國家已經淘汰。Taqman探針檢測屬于實時定量PCR技術，是一種快速的高通量檢測方法，它在PCR擴增過程中加入一個特異性的熒光探針，通過熒光信號的變化反映產物的增加情況，從而能夠定量分析樣本中的初始模板。近年來，由于taqman探針技術在特異性、靈敏性、準確性方面的獨特優勢，其在檢測基因突變、基因定量等疾病相關檢測領域得到廣泛的承認及應用。然而，該方法仍然存在樣本需要預處理、各實驗室引物探針設計不同、沒有統一標準物質等等問題，對以上問題仍需要進一步研究、解決。在目前重組蛋白藥物常用的哺乳動物細胞系中，CHO細胞，S卩，中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary)因具有無限增殖性，可以傳代百代以上，而成為目前生物工程上廣泛使用的細胞。當今批準正式應用于人類疾病治療或預防的基因工程產品約有三十多種，其中只有一種(乙肝疫苗)是由酵母菌生產，其余所有產品均是由CHO細胞和大腸桿菌生產。與原核的大腸桿菌相比，CHO屬于真核哺乳細胞，能形成有活性的二聚體和糖基化的功能，因此，CHO成為表達復雜生物大分子的理想宿主，其已廣泛用于重組蛋白藥物的制取，是一種重要的工程表達細胞株。綜上所述，本領域急需檢測生物制品中殘余CHO細胞DNA的方法，該方法應具備特異性、靈敏性、操作簡便、標準統一等優點，從而能用于生物制品質量控制。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供檢測CHO細胞基因組DNA的引物對、包含該引物對的試劑盒以及利用該引物對檢測CHO細胞基因組DNA的方法在第一方面，本專利技術提供一種檢測CHO細胞基因組DNA的引物對，所述引物對包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物結合于CHO細胞基因組DNA上SEQ ID NO:1所示區段的第64-92位；其中的反向引物結合于CHO細胞基因組DNA上SEQ ID NO:1所示區段的第125-147位，并且所述引物對所擴增獲得的擴增產物的長度為78-84bp。在優選的實施方式中，所述正向引物結合于CHO細胞基因組DNA上SEQ IDN0:1所示區段的第67-92位，所述反向引物結合于CHO細胞基因組DNA上SEQID NO:1所示區段的第125-144位，并且所述引物對所擴增獲得的擴增產物的長度為78bp。在優選的實施方式中，所述正向引物和反向引物的長度為29_20bp ;優選26和20bpo在優選的實施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm溫度為58_60°C，并且正向引物的Tm與反向引物的Tm的差值的絕對值< 2°C。在另一優選的實施方式中，所述正向引物如SEQ ID N0:3所示，所述反向引物如SEQ ID NO:4 所示。在第二方面，本專利技術提供一種檢測體系，所述檢測體系包含本專利技術第一方面所述的引物對。在優選的實施方式中，所述檢測體系還包含第二引物對，所述第二引物對包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物結合于CHO細胞基因組DNA上SEQ IDNO: 2所示區段的第1-22位；所述反向引物結合于CHO細胞基因組DNA上SEQ IDN0:2所示區段的第86-110位，并且所述引物對所擴增獲得的擴增產物的長度為80-110bp。在優選的實施方式中， 所述正向引物結合于CHO細胞基因組DNA上SEQ IDN0:2所示區段的第1-19位，所述反向引物結合于CHO細胞基因組DNA上SEQ IDN0:2所示區段的第89-110位，并且所述引物對所擴增獲得的擴增產物的長度為llObp。在優選的實施方式中，所述正向引物和反向引物的長度為16_24bp。在優選的實施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm溫度為58_60°C，并且正向引物的Tm與反向引物的Tm的差值的絕對值< 2°C。在優選的實施方式中，所述第二引物對中所述正向引物如SEQ ID NO:5所示，所述反向引物如SEQ ID N0:6所示。在另一優選的實施方式中，所述檢測體系還包含探針。在優選的實施方式中，所述探針是5-FAM-TITCATCAGGCCAAAGGCACCTCTGT-TRAMA-3和 / 或 5-FAM-TCCAGGGCTTGCAGTCTACTTAGAACAGCC-TAMRA-3。在優選的實施方式中，所述檢測體系的檢測靈敏度為106-lfg/iU，優選地，所述檢測體系的檢測靈敏度為0.lfg/u1.在第三方面，本專利技術提供一種CHO細胞基因組DNA的檢測方法，所述方法包括:利用本專利技術第一方面所述的引物對或本專利技術第二方面所述的檢測體系，對待測樣品進行PCR，并檢測PCR擴增產物。在第四方面，本專利技術提供一種PCR試劑盒，所述試劑盒中包括容器以本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種檢測CHO細胞基因組DNA的引物對，其特征在于，所述引物對包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物結合于CHO細胞基因組DNA上SEQ?IDNO:1所示區段的第64?92位；其中的反向引物結合于CHO細胞基因組DNA上SEQID?NO:1所示區段的第125?147位，并且所述引物對所擴增獲得的擴增產物的長度為78?84bp。
【技術特征摘要】
1.一種檢測CHO細胞基因組DNA的引物對，其特征在于，所述弓I物對包括正向弓I物和反向引物，其中所述正向引物結合于CHO細胞基因組DNA上SEQ IDNO:1所示區段的第64-92位；其中的反向引物結合于CHO細胞基因組DNA上SEQID NO:1所示區段的第125-147位，并且所述引物對所擴增獲得的擴增產物的長度為78-84bp。2.如權利要求1所述的引物對，其特征在于，所述正向引物如SEQID N0:3所示，所述反向引物如SEQ ID N0:4所示。3.—種檢測體系，其特征在于，所述檢測體系包含權利要求1或2所述的引物對。4.如權利要求3所述的檢測體系，其特征在于，所述檢測體系還包含第二引物對，所述第二引物對包括正向引物和反向引物，其中所述正向弓I物結合于CHO細胞基因組DNA上SEQID N0:2所示區段的第1-22位；所述反向引物結合于CHO細胞基因組DNA上SEQ ID NO:2所示區段的第86-110位，并且所述引物對所擴增獲得的擴增產物的長度為80-110bp。5.如權利要求3或4所述的檢測體系，其特征在于，所述檢測體系還包含探針。6.如權利要求3-5中任一項所述的檢測體系，其特征在于，所述檢測體系的檢測靈敏度為IO6-1 fg/Ul，優選地，所述檢測體系的檢測靈敏度為0.1 fg/yl。7.一種CHO細胞基因組DNA的檢測方法，所述方法包括:利用權利要求1或2所述的引物對或權利要求3-5中任一項所述的檢測體系，對待測樣品進行PCR，并檢測PCR擴增產物。8.—種PCR試劑盒，所述試劑盒中包括容器以及位于所述容器中的權利要求1或2所述的引物對。9.如權利要求8所述的PCR試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括第二引物對，所述第二引物對包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物結合于CHO細胞基因組DNA上SEQ ID NO:2所示區段...
【專利技術屬性】
技術研發人員：孫瑋潔，楊志行，吳婉欣，文明，
申請(專利權)人：中國科學院上海生命科學研究院湖州營養與健康產業創新中心，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。