一種NKCC1基因cRNA原位雜交的探針及其設計方法技術

本發明專利技術公開了一種NKCC1基因cRNA原位雜交的探針及其設計方法，本發明專利技術通過對動物建立模型后進行灌注、取材、切片，通過地高辛標記的cRNA探針與組織中NKCC1基因的mRNA發生特異性的結合，從而方便、準確的觀察到組織中NKCC1基因mRNA水平的變化。本發明專利技術使用的NKCC1的探針序列，對NKCC1基因的顯示有明確的特異性，實現了對NKCC1基因mRNA水平的顯示作用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物醫學領域，涉及一種探針及其設計方法，尤其是一種NKCCl基因cRNA原位雜交的探針及其設計方法。
技術介紹
氯離子是細胞內最重要陰離子。在神經系統，神經元內外氯離子濃度保持相對平衡狀態，是維持神經元和局部環路形態和機能穩定的內環境基礎。一旦氯離子失去平衡，將直接導致神經系統疾病產生。目前已經發現，氯離子失衡可導致是包括帕金森病、癲癇、缺血缺氧、阿爾茨海默病、腦震蕩、神經病理性痛、脊髓損傷、糖尿病性神經病、精神分裂癥和小腦共濟失調等多種神經系統疾病的重要因素。氯離子是由細胞膜上的氯離子轉運體負責運入或者運出細胞。目前為止共克隆得到8個氯離子轉運體蛋白分子:包括2個NKCC蛋白、4個KCC蛋白、I個NCC蛋白以及I個CIP蛋白。NKCCl是神經系統內最重要的降低神經元內氯離子濃度的蛋白。NKCCl全名為鉀濃度梯度驅動的氯離子外向轉運體。NKCCl的工作原理是:按1:1的比例將I個鉀離子轉運入胞體，同時將I個氯離子轉運出胞體。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種NKCCl基因cRNA原位雜交的探針及其設計方法。本專利技術的目的是通過以下技術方案來解決的:一種NKCCl基因cRNA原位雜交的探針，該探針的序列為:

【技術保護點】
一種NKCC1基因cRNA原位雜交的探針，該探針的序列為：5“att?gtgggaattt?gtaatatcag?aagcaaaacg?gtttctcaca?cactgctgtt?ttgatagtgctgtagttgg?tttgacatcg?attctctcct?ttctcagtct?ctgtagactg?aagtggataa?cggatcgggtcatttgcctc?ttctcagagt?gttttcacta?ttgaaagtgt?ggtacagata?cattgcacgt?tgttctccacggccaggtag??tttagcagga??atctgtggtt??accccgaaga??tttagaaaga??ctttcacctggaggctgtaa?tgcgcctgga?acctacctag?atgcttccta?gggacatgtt?ttgtttctgt?tttaattcaaatctcagtaa?caaagcccta?caggttctca?aagctgtagg?ttttgttttt?ggtgtgcctg?ttcttggcatttttggtagt??gtccagaaaa??cagcacttgt??gtggcagttg??aaggagtggg??cctgagccgcctgagctccc?tgggaaggtt?agaaagaagt?gcgg?3“。...

【技術特征摘要】
1.一種NKCCl基因cRNA原位雜交的探針，該探針的序列為: ·5’ att gtgggaattt gtaatatcag aagcaaaacg gtttctcaca cactgctgttttgatagtgctgtagttgg tttgacatcg attctctcct ttctcagtct ctgtagactg aagtggataacggatcgggtcatttgcctc ttctcagagt gttttcacta ttgaaagtgt ggtacagata cattgcacgttgttctccacggccaggtag tttagcagga atctgtggtt accccgaaga tttagaaagactttcacctg gaggctgtaa tgcgcctgga acctacctag atgcttccta gggacatgtt ttgtttctgttttaattcaaatctcagtaa caaagcccta caggttctca aagctgtagg ttttgttttt ggtgtgcctgttcttggcatttttggtagt gtccagaaaa cagcacttgt gtggcagttg aaggagtgggcctgagccgcctgagctccc tgggaaggtt agaaagaagt gcgg 3’ 02.如權利要求1所述探針的設計方法，其特征在于: (1)根據NKCCl的Genebank序列設計NKCCl特異的引物，并且此對引物擴增出437bp的NKCCl片段作為NKCCl特異的探針序列； (2)構建NKCCI的cRNA原位雜交的探針質粒；將探針質粒轉化細菌后，細菌培養后進行測序； (3)制備NKCCI的cRNA原位雜交探針； (4)檢測NKCCl的cRNA探針的原位雜交。3.如權利要求2所述的設計方法，其特征在于，所述步驟⑴中NKCCl特異的引物是:上游引物是 5’GAC ACC CAC ACC AAC ACC TA 3’ ； 下游引物是 5’GTA CGC TCC TCC TCC TCT CA 3’。4.如權利要求2所述的設計方法，其特征在于，所述步驟(2)按照如下步驟進行: (a)將小鼠的cDNA用NKCCl特異的引物進行PCR擴增； (b)將PCR產物用TIANGEN膠回收試劑盒進行膠回收； (c)將回收后的產物于4°C與多克隆位點兩端具有T7、SP6啟動子的載體進行連接； (d)將連接好的質粒轉化細菌后，細菌培養后進行測序。5.如權利要求2所述的設計方法，其特征在于，所述步驟(3)按照如下步驟進行: (a)步驟(2)得到的細菌測序正確后，經判斷確認NKCCI探針序列插入載體的順序是反向的； (b)需要使用XbaI限制性內切酶對質粒進行酶切； (c)將酶切產物用TIANGEN膠回收試劑盒進行膠回收； (d)用T7RNA聚合酶對探針進行體外轉錄標記。6.如權利要求2所述的設計方法，其特征在于，所述步驟(4)按照如下步驟進行: (a)將小鼠用0.4%戍巴比妥鈉深麻后，經左心室插管至升主動脈,用0.0lmol/L的DEPC-PBS的快速沖洗去除血液，再以4%多聚甲醛灌注固定；所述的0.0lmol/L DEPC-PBS是·2.9克磷酸氫二鈉,0.29克磷酸二氫鈉,9.0克氯化鈉用超純水定容至IL后，再加入體積百分比為0.1%的...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王亞云，楊雁靈，魏燕燕，郭保霖，隋秉東，鄭晨曦，李云慶，
申請(專利權)人：中國人民解放軍第四軍醫大學，
類型：發明
國別省市：