本發明專利技術提供了一種以磷脂酰絲氨酸為靶點的放射性藥物99Tcm-Cys-AnnexinV，膜聯蛋白AnnexinV?的羧基端連有半胱氨酸Cys，半胱氨酸的巰基上標記有放射性核素99Tcm。可采用直接標記法對Cys-AnnexinV進行99Tcm標記，步驟包括：（1）取適量的SnCl2加入Cys-AnnexinV使蛋白亞錫化；（2）向步驟（1）蛋白亞錫化后的Cys-AnnexinV中加入99TcmO4-，混勻后放置，即形成99Tcm-Cys-AnnexinV。本發明專利技術所用標記方法更為簡便實用，且能盡可能保持標記蛋白活性和生物功能，用于進行放射性核素顯像，檢測各種疾病中細胞凋亡發生的程度和范圍，尤其是作為顯像劑在檢測細胞凋亡和血栓中的應用。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于放射性核素標記
,具體涉及一種99Tcm-Cys-AnnexinV標記化合物及其標記技術和作為顯像劑在急性心肌損傷、腫瘤療效評價以及急性血栓探測方面的應用。
技術介紹
細胞凋亡(apoptosis)是一種高度保守的細胞程序性死亡(P⑶)，在諸多生理和病理過程中起著重要的作用。過 度凋亡會使組織功能喪失，如急性心肌梗死、慢性心力衰竭、移植排斥反應、中風、神經系統變性疾病等。相反，系統性紅斑狼瘡及類風濕關節炎以凋亡不充分為特征，使免疫細胞大量存活而不恰當地殺死和破壞正常組織，使組織臟器功能受損。凋亡抑制導致細胞過度增殖和腫瘤形成，許多化療藥物多是通過誘導凋亡來實現治療目的的。但目前常規的細胞凋亡檢測方法還不能滿足基礎研究和臨床實踐的需要，已有的實驗室檢測手段只能從細胞形態學和生化改變方面進行體外的定性和定量分析，如電鏡觀察、流式細胞分析、DNA降解條帶分析和相關蛋白表達水平檢測等。在活體條件下觀察細胞凋亡范圍、時相和發展速度等，一直是研究的一大難題。特別是在心血管系統疾病的研究中，活體標本采集尤為困難，因此活體顯像顯得更為必要。近年來，國內外已開展有關細胞凋亡放射性核素顯像的研究，研究的關鍵是合成能與凋亡細胞特異結合的顯像劑，且物理化學特性適于放射性核素標記，并具有血液清除快，靶器官顯像清晰等特點。放射性核素標記磷脂結合蛋白V (Annexin V)是目前最受關注的細胞凋亡顯像劑之一。Annexin V是一種人體內源性蛋白，屬于Ca2+依賴性磷脂結合蛋白家族，最早是從胎盤中分離出來，具有一些抗凝固及抗炎的作用，曾被作為一種抗凝劑研究。染色體定位分析顯示，Annexin V是由位于人的第4條染色體4q26_q28上的Annexin V基因編碼,含有319個氨基酸，包括個70-80氨基酸重復單元，分子量約為35kD。研究證實，Annexin V能與凋亡細胞表面的磷脂酰絲氨酸(PS)特異性結合，正常細胞的PS位于細胞膜內層，凋亡時表達在細胞膜外層，是細胞凋亡的特征性標志，Annexin V與PS的親和力高達10_9mol/L。Annexin V類顯像劑的合成關鍵是放射性核素的標記，既要獲得較高的放射化學純度，同時又不能損傷Annexin V的結合活性。目前研究最成功的是99Tcm標記的AnnexinV(99Tcm-Annexin V)。99Tcm具有優良的物理性質，且獲取容易，價格低廉。目前采用99Tcni標記Annexin V有多種方式1.雙功能鰲合劑法。使用雙功能鰲合劑法選擇連接劑非常重要，既要保證與99Tcm有很高的配位能力，又要保證不改變其原有生物活性。常用的有二硫二氮(N2S2)、乙二胺半胱氨酸(EC)、BTAP等，其中以肼基煙酰胺(Hynic)最為多見。目前，多數臨床前研究采用Hynic為螯合劑進行99Tcm標記Annexin V,得到的99Tcm-Hynic-Annexin V比活度較高,放射性化學純度大于90%，并且已經在凋亡動物模型中獲得良好的評估，被認為是監控腫瘤治療療效潛在的有效的放射性藥物。但雙功能鰲合劑法過程比較復雜，對技術條件要求嚴格，制備成本聞。2.直接還原標記法 直接還原標記法相對于雙功能鰲合劑法更為簡便、理想，以往的研究認為以SnCl2為還原齊U、中性PH條件下，可得到標記率高(>95%)、穩定性好(>10h)的99Tcm-AnnexinV標記產物，且易于藥盒化，但由于99Tcm與AnnexinV中的巰基相結合,會使AnnexinV的活性會受到影響，產生一些變性蛋白，使肝臟的放射性攝取增加。3.對Annexin V進行結構修飾 國外 Tait JF 等學者(Tait JF, Brown DS, Gibson DF, Blankenberg FG, StraussHW. Development and characterization of annexin V mutants with endogenouschelation sites for 99mTc. Bioconjug Chem 2000; 11:918 - 25)通過修飾Annexin V的結構，在Annexin V的N端延長了 7個氨基酸(含一個或兩個半胱氨酸殘基)形成變異分子Annexin V116、117和118,三種蛋白可在大腸桿菌細胞質中表達并可純化成同質體,與紅細胞膜上的PS都有較高的親和力。用在Annexin V上加肽序列的方法，使之形成了與99Tcm結合的內生螯合位點。以SnCl2為還原劑，葡庚糖酸鹽(GH)為轉換劑，三種蛋白可特異性結合99Tcm至少1850 3700MBq (50 IOOmCi)，且標記后性質穩定，保持了與膜PS的親和力。
技術實現思路
為克服已有技術的缺點，本專利技術的目的在于提供一種標記方法更為簡便實用，且能盡可能保持標記蛋白活性和生物功能的標記化合物，用于進行放射性核素顯像，檢測各種疾病中細胞凋亡發生的程度和范圍。 為達到上述目的，本專利技術的技術方案具體如下 一種以磷脂酰絲氨酸為祀點的放射性藥物99Tcm-Cys-AnnexinV,膜聯蛋白AnnexinV的羧基端連有半胱氨酸Cys，半胱氨酸的巰基上標記有放射性核素Tc'上述放射性藥物為無色透明液體針劑。本專利技術還提供了一種上述放射性藥物99Tcn1-Cys-AnnexinV的標記方法，采用直接標記法對Cys-Annexin V進行99Tcm標記,步驟包括 (1)取適量的SnCl2加入Cys-AnnexinV使蛋白亞錫化； (2)向步驟(I)蛋白亞錫化后的Cys-AnnexinV中加入99Tcm04_,混勻后放置，即形成99Tcm-Cys-Annexin V。上述的放射性藥物99Tcn1-Cys-AnnexinV的標記方法，可以具體為 (1)取適量的SnCl2·2Η20，以濃度為O. 05mol/L的HCl溶解，取已配制好的上述含SnCl2的ΙΟΟμ ，總計亞錫量約25 3(^g依次加入Cys-Annexin V 5 5(^g后充分搖勻； (2)向步驟(I)蛋白亞錫化后的Cys-AnnexinV中加入99Tcm04_0. 8mL, 10mg/mL維生素C IOOPL,混勻后放置，即形成 99Tcm-Cys-Annexin V。本專利技術還提供了一種99Tcm-Cys-AnnexinV作為顯像劑用于檢測心肌缺血損傷后心肌細胞凋亡即探測急性心肌損傷方面的用途。本專利技術還提供了一種99Tcm-Cys-AnnexinV作為顯像劑用于化療后檢測腫瘤細胞凋亡即腫瘤化療后療效評價方面的用途。本專利技術還提供了一種99Tcm-Cys-AnnexinV作為顯像劑用于探測活化血小板水平即檢測急性血栓方面的用途。本專利技術所述的99Tcm-Cys-AnnexinV顯像劑采用了一種新的Annexin V衍生物Cys-Annexin V作為99Tcm標記的底物,首次采用直接標記法實現了 Cys-Annexin V的99Tcm標記，由于本專利技術技術方案中99Tcm僅對AnnexinV羧基端的Cys上的巰基進行了標記，避開Annexin V的結合單位和功能區,保護膜聯蛋白的生物學功能。本專利技術技術方案不僅保持了膜聯蛋白的活性本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種以磷脂酰絲氨酸為靶點的放射性藥物99Tcm?Cys?AnnexinV，其特征在于膜聯蛋白AnnexinV?的羧基端連有半胱氨酸Cys，半胱氨酸的巰基上標記有放射性核素99Tcm。
【技術特征摘要】
1.一種以磷脂酰絲氨酸為靶點的放射性藥物99Tcm-Cys-AnnexinV,其特征在于膜聯蛋白AnnexinV的羧基端連有半胱氨酸Cys,半胱氨酸的巰基上標記有放射性核素99Tcm。2.如權利要求1所述的放射性藥物，其特征在于所述放射性藥物為無色透明液體針劑。3.—種如權利要求1所述的放射性藥物99Tcm-Cys-AnnexinV的標記方法,其特征在于采用直接標記法對Cys-Annexin V進行99Tcm標記,步驟包括 (1)取適量的SnCl2加入Cys-AnnexinV使蛋白亞錫化； (2)向步驟(I)蛋白亞錫化后的Cys-AnnexinV中加入99Tcm04_充分混勻后放置，即形成 99Tcm-Cys-Annexin V。4.如權利要求3所述的放射性藥物99Tcm-Cys-AnnexinV的標記方法,其特征在于所述步驟(2)還加入維生素C保持溶液穩定性。5...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王峰，華子春，胡敏進，方緯，王自正，
申請(專利權)人：南京市第一醫院，華子春，江蘇靶標生物醫藥研究所有限公司，中國醫學科學院阜外心血管病醫院，
類型：發明
國別省市：
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