本發明專利技術公開了一種植物乳桿菌定量檢測方法及其檢測試劑盒和應用。該植物乳桿菌（Lactobacillus?plantarum）定量檢測方法包括：（1）提取待檢樣品的總RNA；（2）將提取的總RNA反轉錄成cDNA；（3）采用特異性擴增植物乳桿菌的引物對，以所得cDNA為模板，進行熒光定量PCR擴增，其中上游引物序列如SEQ?ID?No:1所示；下游引物序列如SEQ?ID?No:2所示；（4）通過比較待檢樣品的Ct值和定量外標準品的標準曲線測定其中植物乳桿菌數量。本方法能夠有效排除其他細菌，尤其是近緣菌的干擾，只檢測樣品中存活的植物乳桿菌數量。本發明專利技術所述植物乳桿菌定量檢測試劑盒使用簡便，檢測效率高。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物工程領域，特別是涉及一種植物乳桿菌定量檢測方法，所述植物乳桿菌定量檢測方法是定量熒光PCR方法，一種植物乳桿菌定量檢測試劑盒及其應用。
技術介紹
植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)是乳酸桿菌中的一種，與人類的生活關系密切，常存在于發酵的蔬菜和果汁中。植物乳桿菌作為人體胃腸道的益生菌群，具有維持腸道內菌群平衡、提高機體免疫力和促進營養物質吸收等多種功能，因而被廣泛的作為·益生菌添加到功能性食品與保健品中。大量研究表明，只有產品中益生菌的活菌數達到I X IO6個/ML才能夠發揮其應有的功效，因而益生菌活菌數量是評價益生菌制品質量的重要指標。然而目前對多菌復合產品中的植物乳桿菌的定性、定量檢測方面缺乏科學、合理、快速的方法。傳統生理生化方法易受選擇培養基、培養條件、菌種特性等因素影響，檢測效率有限，且耗時時間長，一般要2-3天；以16S rDNA序列同源性分析作為細菌系統發育和親緣關系研究已被普遍應用于乳酸菌的分類鑒定中，但由于植物乳桿菌與戊糖乳桿菌、副植物乳桿菌等具有99%的相似性，利用該方法只能鑒定到屬而無法準確到種。伴隨著高通量測序技術的快速發展，大量乳酸菌菌株的基因組圖譜已被解析。這些基因組數據可以使我們了解不同益生菌的遺傳結構和特點，找出不同菌株的專有特征，從而為不同種乳酸菌的區分和鑒定奠定了基礎。
技術實現思路
因此，本專利技術要解決的技術問題就是針對現有的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)的菌數檢測方法易受培養基、培養條件、菌種特性等因素影響，并且檢測耗時時間長，檢測效率較低的缺陷，提供一種植物乳桿菌定量檢測方法及其檢測試劑盒和應用。本專利技術所述植物乳桿菌定量檢測方法及其檢測試劑盒靈敏度高，特異性強，穩定性好，操作簡單、迅捷，能極大提高乳制品中乳桿菌數量的檢出效率。為解決上述技術問題，本專利技術采取的技術方案之一為一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)定量檢測方法,其中所述方法包括以下步驟(I)提取待檢樣品的總RNA ；(2)將步驟(I)提取的總RNA反轉錄成cDNA ；(3)采用特異性擴增植物乳桿菌的引物對，以步驟(2)所得cDNA為模板，進行熒光定量PCR擴增檢測，其中所述特異性擴增植物乳桿菌的引物對為上游檢測引物，其序列如序列表中SEQ ID No:1所示;下游檢測引物，其序列如序列表中SEQ ID No:2所示；(4)通過比較待檢樣品的Ct值和定量外標準品的標準曲線測定樣品中植物乳桿菌的數量。本專利技術所述植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)也可簡寫為植物乳桿菌(L. plantarum),其余乳桿菌命名規則與之相同。其中步驟(I)所述提取待測樣品總RNA的方法為本領域常規的總RNA提取方法。所述總RNA的提取較佳地為通過本領域各種商用的RNA提取試劑盒進行。其中步驟(2)所述RNA反轉錄成cDNA的方法為本領域常規的反轉錄方法。所述反轉錄較佳地為利用各種商用反轉錄試劑盒進行。其中步驟(3)所述特異性擴增植物乳桿菌的引物對包括上游測序引物和下游測序引物，其中上游測序引物5’ -GGAGCCGCTATTAGTATTTTCAT-3’，其序列如序列表中SEQ IDNo:1所示；下游檢測引物5 ’ -AATACAAGCAAGTCTTGGA CCAG-3 ’，其序列如序列表中SEQ IDNo: 2所示。所述引物的制備方法為本領域常規制備方法，較佳地為通過人工合成途徑即得，可以委托服務商進行全序列合成即得。其中步驟(3)所述熒光定量PCR擴增為本領域常規的熒光定量PCR擴增技術。所述熒光定量PCR程序較佳地為(1)94°C 95°C，25 30秒；(2)94°C 95°C，5 15秒，(3) 60°C，20 30秒，其中步驟(2) (3)重復30 45個循環，更佳地為(I) 95°C 30S ;(2)95°C 5S，(3) 60°C 25S，步驟(2) (3)重復 40 個循環；4°C保存。其中步驟(3)所述植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)為本領域常規的植物乳桿菌。本專利技術所述植物乳桿菌較佳地選自植物乳桿菌(L. plantarum) ST-1I1、植物乳桿菌(L. plantarum)WCFSl、植物乳桿菌(L. plantarum)P8 和植物乳桿菌(L. plantarum)CCTCCNo. M206033中的一種或幾種。其中步驟(4)所述的定量外標準品較佳地為植物乳桿菌(L. plantarum)ATCC14917的總RNA反轉錄后所得的總cDNA，其中所述標準曲線較佳地是將外標準品采用10倍梯度水稀釋，以稀釋后的外標準品作為底物進行定量PCR反應得到Ct值，根據稀釋后標準品的拷貝數和其相對應的Ct值繪制而得。熒光染料產生的熒光信號可以被熒光定量PCR儀內的熒光信號采集系統檢測，熒光量的增加與PCR產物的積累量成正比例關系。對植物乳桿菌的定量可以通過與定量標準品的循環閾值(Ct，Thresho I d Cyc I e )相比較得出。Ct值是PCR過程中，熒光量的積累超過基底熒光量的循環數。Ct值與起始模板數成一定比例關系，Ct值越小，起始模板數越多；相反，Ct值越大，起始模板數越少。因此，利用梯度稀釋標準品的Ct值制成標準曲線，再根據待測樣品的Ct值可以準確測出該樣品的起始拷貝數。為解決上述技術問題，本專利技術采取的技術方案之二為一種特異性擴增植物乳桿菌的引物對，所述引物對中的上游檢測引物的序列如序列表中SEQ ID No:1所示；其中下游檢測引物的序列如序列表中SEQ ID No:2所示。其中所述特異性擴增植物乳桿菌的引物對的序列分別為上游測序引物5’ -GGAGCCGCTATTAGTATTTTCAT-3’，其序列如序列表中SEQ IDNo:1所示；下游檢測引物5 ’ -AATACAAGCAAGTCTTGGACCAG-3 ’，其序列如序列表中SEQ IDNo: 2所示。所述引物的制備方法為本領域常規制備方法，較佳地為通過人工合成途徑即得，可以委托服務商進行全序列合成即得。為解決上述技術問題，本專利技術采取的技術方案之三為一種植物乳桿菌定量檢測試劑盒，所述定量檢測試劑盒包括SYBR Green I熒光染料、PCR緩沖液、dNTPs溶液、DNA聚合酶、無菌雙蒸水，上游檢測引物和下游檢測引物，其中所述上游檢測引物的序列如序列表中SEQ ID No:1所示，所述下游檢測引物的序列如序列表中SEQ ID No:2所示。其中所述SYBR Green I熒光染料、PCR緩沖液、dNTPs溶液、DNA聚合酶、無菌雙蒸水均為本領域常規實驗試劑，均市售可得。其中所述植物乳桿菌定量檢測試劑盒，較佳地還包括定量外標準品。所述定量外標準品是本領域常規的外標準品，較佳地是植物乳桿菌ATCC14917的總RNA反轉錄后所得總 cDNAo其中所述植物乳桿菌定量檢測試劑盒，較佳地還包括RNA提取試劑和/或反轉錄試劑。所述RNA提取試劑較佳地為Trizol、RNA酶抑制劑。其中所述反轉錄試劑較佳地為逆轉錄酶(AMV)、AMV緩沖液。其中所述AMV緩沖液較佳地包括dNTPs、隨機引物、RNA酶抑本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種植物乳桿菌（Lactobacillus?plantarum）定量檢測方法，其特征在于，所述植物乳桿菌定量檢測方法包括以下步驟：（1）提取待檢樣品的總RNA；（2）將步驟（1）提取的總RNA反轉錄成cDNA；（3）采用特異性擴增植物乳桿菌的引物對，以步驟（2）所得cDNA為模板，進行熒光定量PCR擴增檢測，其中所述特異性擴增植物乳桿菌的引物對為：上游檢測引物，其序列如序列表中SEQ?ID?No:1所示；下游檢測引物，其序列如序列表中SEQ?ID?No:2所示；（4）通過比較待檢樣品的Ct值和定量外標準品的標準曲線測定樣品中植物乳桿菌的數量。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳臣，任婧，周方方，艾連中，
申請(專利權)人：光明乳業股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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